测序原理
ABI公司在双脱氧法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒（BigDye试剂）。接着再结合毛细管电泳生产出“ABI3730”和“ABI3500”等测序仪。
原理：
双脱氧法测序的第一个核心技术就是在用DNA聚合酶合成DNA链的过程中掺入双脱氧核苷酸（ddNTP）。
天然DNA组成元件是单脱氧核苷酸（dNTP），其糖基的3’和5’位各有一个羟基，5’位的羟基连接到上游的磷酸基团，不断重复，形成一条DNA骨架链。
Sanger的方法就是用化学合成的方法合成出3位’没有羟基的核苷酸，这就是双脱氧核苷酸。
BigDye试剂包括四种荧光标记的ddNTP，dNTP，DNA聚合酶，镁离子，PH缓冲液等。
反应得到的一系列不同长短的DNA片段经过纯化后，去掉游离的荧光ddNTP单核苷酸，上机测序。
超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。
第一轮扩增模版： flowcell表面固定的序列 --> 模版链
去杂： 加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性，互补链由于和lane上短序列强力连接固定住了；模板链失去了双链氢键连接，好似悬空，它会被洗脱
**桥式形成： **加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的）就像下图这样（摘自illumina官网）目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半
illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法确定cluster的碱基排序顺序。
一轮测序是这样完成的：
双端测序之Forward Strand ：
先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。
再向下一轮： 再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。
Index测序： 上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
双端测序之Reverse Strand：
洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。
single-end
只将index，Primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列。
