Question

把质粒转入细胞的方法步骤是什么啊请教一下

Answer 1

要看你是什么细胞，是想过表达还是knock down一个基因，稳转还是瞬转。
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。
方法

脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。

电穿孔转染法
电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。

病毒感染
对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。
常用步骤
1. 转染试剂的准备
① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
② 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。
2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体[1] 体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

Answer 2

将质粒转入细胞常见的方法包括电穿孔法、化学转染法（如脂质体转染）和病毒介导转染等。以下以脂质体转染法为例，介绍一般的步骤：

一、准备工作

• 培养细胞

• 在转染前一天，将细胞接种于培养板或培养皿中，使细胞在转染时达到 70% - 90% 的汇合度。

• 准备质粒和转染试剂

• 提取高质量的质粒 DNA，确保无蛋白质、RNA 等杂质污染。

• 按照转染试剂的说明书，准备适量的转染试剂。




二、制备转染复合物




• 在无菌离心管中，分别加入适量的无血清培养基。

• 在其中一管中加入适量的质粒 DNA，轻轻混匀。

• 在另一管中加入适量的转染试剂，轻轻混匀。

• 将含有转染试剂的培养基逐滴加入含有质粒 DNA 的培养基中，轻轻混匀。室温下孵育 15 - 20 分钟，形成转染复合物。




三、转染细胞




• 将培养板或培养皿中的细胞培养基更换为无血清培养基。

• 将制备好的转染复合物逐滴加入细胞培养孔或培养皿中，轻轻摇匀。

• 将细胞放回培养箱中，在适当的条件下（温度、CO₂ 浓度等）继续培养。




四、培养与检测




• 培养 4 - 6 小时后，更换为含血清的完全培养基。

• 继续培养 24 - 72 小时，根据实验目的选择合适的时间点进行检测，如通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达、通过 PCR 或 Western blot 检测目的基因的表达等。




需要注意的是，不同的细胞类型和转染方法可能会对转染效率产生影响，因此在进行转染实验前，建议进行预实验优化转染条件。




另外，电穿孔法的大致步骤如下：




• 准备细胞

• 收集处于对数生长期的细胞，用适当的缓冲液洗涤并调整细胞浓度。

• 制备质粒溶液

• 将待转染的质粒溶解在适当的缓冲液中。

• 电穿孔操作

• 将细胞和质粒溶液混合后加入电穿孔杯，设置合适的电穿孔参数（如电压、脉冲时间、脉冲次数等），进行电穿孔处理。

• 培养与检测

• 电穿孔处理后的细胞转移至培养皿或培养瓶中，在适宜条件下培养，然后进行检测分析。




每种方法都有其优缺点，您可以根据具体的实验需求和细胞类型选择合适的转染方法。

Answer 3

可以分享一下 DeofectEU Transfection Reagent转染质粒细胞
A. 细胞接种:
1. 转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞；
2. 过夜培养。
B. DeofectEU /DNA复合物包装(该步完成后应立即转染):
1. 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的转染试剂(2~5µl/µg DNA，参见下表) 。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。
2. 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的DNA (0.8~1µgDNA/孔， 参见附表)。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。
3. 将DeofectEU-培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后，立即转染。注意： DeofectEU-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。