Question

如何避免荧光定量pcr检测技术的实验误差

Answer 1

避免荧光定量pcr检测技术的实验误差的方法如下：

1. 样品的处理及选取

   处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。选取实验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，样品选好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。

2. 核酸提取

   加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核酸质量，RNA OD260/280=2.0左右，DNA OD260/280=1.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。

3. 得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放。

4. 对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找到表达恒定基因作为内参。

5. 做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量采用排枪。

6. 体系中最好参入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。

7. 重复操作

   让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。

   同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。

Answer 2

　　误差是难以避免的 只要操作的时候小心。相关系数要想接近1，最好去掉一个不是很准的点，或者可以做三组标准品的平行，最好是事先把所有东西都混成一个MIX，然后三个孔一起加。