Question

简介双脱氧链终止法进行DNA测序的原理和方法。

Answer 1

【答案】：原理：双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2’和3'碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3'碳上有一个羟基。在DNA复制过程中，新掺入的碱基按碱基互补配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5'-α-P同生长链的前一个核苷酸的3'羟基连接。但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3'没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，导致DNA复制终止。
方法：将待测序的单链DNA的模板、引物、四种单脱氧碱基和DNA聚合酶分成四管，在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3'端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。[考点]双脱氧链终止法的原理和方法。英国剑桥大学分子生物学实验室的F.Sanger在1977年发明了用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定DNA的序列的方法。由于这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此也被称为引物合成法或酶催引物合成法。