Question

荧光定量PCR，实验组和对照组的目的基因CT值非常相近，两组内参基因的CT值相差5左右，正常吗？

Answer 1

肯定不行的。荧光定量pcr通过以内参基因作为标准进行相对定量，即众所周知的2–ΔΔCT 法，（前提是要求在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因，而且表达水平不受研究条件及处理方式的影响）。如果实验组和对照组的目的基因ct值非常接近（前提是cDNA稀释的倍数一致）， 说明二者的目的基因无明显变化呀。

4.2.3.1 2–ΔΔCT (Livak) 方法
进行相对基因表达分析普遍采用操作简便的2–ΔΔCT 法，条件是目标基因和参照基
因扩增效率都接近100% 且相互间效率偏差在5% 以内。使用2–ΔΔCT 法之前，必须验
证目标基因和参照基因的扩增效率。
一旦确定目标基因和参照基因有相似且接近100% 的扩增效率，你就可以确定不
同样本中目标基因表达水平的相对差异，步骤如下：
首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT 值归一目标基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校准样本的ΔCT 值归一试验样本的ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，计算表达水平比率：
2–ΔΔCT = 表达量的比值
得到的结果是通过参照基因表达水平校准的试验样本中目标基因相对于校准样本
的增加或减少的倍数，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。
如果目标和内参基因的扩增效率不相近，可以优化或重新设计实验，或者可以
采用4.2.3.3 节中阐述的Pfaffl 法。另外，如果目标基因和参照基因有同样的扩增效
率，但是扩增效率不等于2，那么，2–ΔΔCT 法的公式可以修正为用实际扩增效率值代
替等式中的2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为1.95，计算公式为
1.95–ΔΔCT。

下边的假定的例子告诉你如何使用2-ΔΔCT 法来决定一个目标基因（p53）在肿瘤
和正常卵巢组织的表达的相对水平。
例子：正常和肿瘤组织50ngRNA 得到的cDNA 用来分析p53(目标基因)和
GAPDH（参照基因）。GAPDH 用来作为参照是因为以前的研究表明这个基因在正常
和肿瘤组织中没有差异。
样品CT p53 (目标基因) CT GAPDH (参照基因)
正常(校准样本) 15.0 16.5
肿瘤(试验样本) 12.0 15.9
为了用上面介绍的方法进行相对定量分析，在检测和校准的样品中靶基因的CT
值和内参的CT 值进行归一化：
ΔCT(正常) = 15.0 – 16.5 = –1.5
ΔCT（肿瘤）= 12.0 – 15.9 = –3.9
然后，试验样本的与校准样本的ΔCT 值进行归一化
ΔΔCT = ΔCT（肿瘤)– ΔCT（正常）
= –3.9 – (–1.5) = –2.4
最后，计算表达比率：
2–ΔΔCT = 2–(–2.4) = 5.3
因此，肿瘤细胞的p53 表达水平比正常细胞高5.3 倍

希望能帮上你。