Question

半定量RT-PCR和定量RT-PCR的区别

Answer 1

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.BIOG染料法荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料或者和目的DNA片段结合的BIOG
taqman,通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.

Answer 2

半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。
1.
半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative
reverse
transcription
and
polymerase
Chain
reaction
,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
2.
定量RT-PCR（quantitative
reverse
transcription
and
polymerase
Chain
reaction
,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

Answer 3

半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。
半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative
reverse
transcription
and
polymerase
Chain
reaction
,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
定量RT-PCR（quantitative
reverse
transcription
and
polymerase
Chain
reaction
,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR需要跑电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低，而定量RT-PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard
Curve来判断gene拷贝数的高低。

Answer 4

半定量rt-pcr参照的做法一般有两种：
1)
将要比较的两个样品的beta-actin
调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。
2)
不进行调平，一个样品里将目的基因和beta-actin直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简单，但结果不够直观。
1.每个标本都要做自己的内参，不能用同一个内参！
2.每个标本在实际做前都要摸最佳循环数，包括内参，但内参的循环数不一定要和目的基因一样，都要选择上升期的中间数作为最佳循环数，否则进入平台期就没有可比性了！所以内参要有它自己的最佳循环数！
3.电泳扫描后，计算灰度值，先用同一标本的内参和目的进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组4个样本以上。这样就可以知道各组之间的差别了！