Question

细胞培养中出现黑点是污染吗，如何处理

Answer 1

培养中常出现一些黑点，是污染吗

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的)，也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。 如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化。

那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关

1.细胞生长过老，破碎的细胞残骸

2.血清质量不好，反复冻融的结果

3.配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长

4.配制培养基的水质、容器不合格

如何预防细胞培养中黑点的产生

掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。

黑点已经产生了，如何进行处理

如果判定黑点是污染，请及时将细胞处理后丢弃。其他情况，可参照以下进行：

如果是悬浮细胞：收集细胞上清慢速离心（500-600 rpm/min，5-6 min）并更换新的培养瓶;如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候，轻轻拍打培养瓶，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液慢速离心（500-600 rpm/min，5-6 min）并更换新的培养瓶，并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。