Question

怎么把mrna从rna中纯化

Answer 1

1. 怎样从总rna中进行mrna的分离和纯化
真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。

真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。

其中 rRNA为75%~ 85%,tRNA占10%~16%，而mRNA仅占1%~5%，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5'端帽子结构（m7G）和3'端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3'端存在20~300个腺苷酸组成的poly(A)尾，通常用poly(A+)表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3' 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）-纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；（2）寡聚（dT）-纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）-纤维素结合，离心收集寡聚（dT）-纤维素/mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）-纤维素；（3）其它一些方法：如寡聚（dT）-磁性球珠法等。本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。

【试剂与器材】 （一）试剂1. 0.1mol/L NaOH ，每组200mL2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。

配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。5. 5 mol/L NaCl，每组10mL6. 3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL7. 无RNase双蒸水（DEPC水），每组100mL8. 70%乙醇，每组10mL 注意：溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜，溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。

溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。（二）器材1. 恒温水浴箱2. 冷冻高速离心机3. 紫外分光光度计4. 巴斯德吸管5. 玻璃棉6. 5ml一次性注射器 【操作方法】 （一） oligo(dT)纤维素的预处理1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2. 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。3. 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。

4. 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。（二） 总RNA浓度的调整1. 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。

把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。2. 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

（三） mRNA的分离1. mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

总RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纤维素（mL）洗涤缓冲液1,2 (mL)洗脱体积（mL）<0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.02. 转移：取1个5ml的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它固定在无RNase的支架上，再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。3. 洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。

测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时准备洗脱。4. 洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3倍柱床体积）的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

5. 测定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脱液组分于4℃，2500g，离心2-3分钟，上清转移至新的离心管中。
2. 怎样从总RNA中提取mRNA
大多数真核细胞mRNA的3'端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合，这就是提取mRNA最基本的原理.具体到实验手段上，现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用.磁珠法一般是用生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）.实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合.用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来.最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可.寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液中，带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上.降低盐浓度，mRNA被洗脱.一般过两次柱后，就可得到较高纯度的mRNA.当然有些mRNA没有polyA尾巴，这种就比较难办了，我最近的实验就是在对付这种东西.如果你是拿mRNA做RT-PCR，其实一般是不必分离mRNA的，设计好引物就可以用总RNA做了.。
3. 信使RNA的mRNA提取分离纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5'端帽子结构（m7G）和3'端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3'端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取 ，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3'末端含有Poly(A+)的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA 1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。2.步骤⑷中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4.寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5.一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%
4. 如何纯化RNA粗制品
RNA纯化及获得纯化要求RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。

避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。

纯化方法及沉淀1、有机溶剂抽提法氯仿抽提：在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而达到纯化RNA的目的。沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。

加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇，室温沉淀20-30分钟，高速离心，可获得RNA沉淀。洗涤沉淀：加入无RNase的75%乙醇，将RNA沉淀振荡悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。

然后再离心10-30分钟，再次沉淀RNA。离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），随后快速离心1-2秒，将残留在管壁上的乙醇收集到管底后，用小枪头吸净，超净台中风干1-2分钟（注意不要晾得太干，否则RNA沉淀不易溶解）。

溶解沉淀：加入适量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。2、硅基质吸附法随着实验方法的改进，现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。

目前较常见的有：硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸，使用方便、快捷，不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点，成为核酸纯化的首选。

Solarbio公司总RNA提取试剂盒就是采用硅基质吸附达到RNA分离纯化目的。通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，最后用RNase-free ddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。

一些特殊组织的RNA提取纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织中RNA含量较低，建议增加起始量。

此外，一定要在液氮中将组织彻底磨碎。蛋白/脂肪含量高的组织：脑或植物脂肪含量高，酚/氯仿抽提后，上清含白色絮状物。

必须用氯仿再次对上清进行抽提。核酸RNase含量高的组织：脾、胸腺等组织的核酸和RNase含量很高。

在液氮中研磨，再快速匀浆，能有效灭活RNase，如加入裂解液后过于粘稠，酚/氯仿抽提不能有效分层，则加入更多裂解液可以解决此问题。多次酚/氯仿抽提可以去除更多残留的DNA。

如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用DNaseI消化，去除DNA污染，植物组织和真菌组织：植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，一般选择在液氮条件下对样品进行研磨，以避免内源RNase降解RNA。如果RNA降解问题不能解决，大多数情况下是样品中含有的杂质所致。

许多植物和真菌中所含杂质如多糖、多酚等都会残留，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可与RNA同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的提取中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。