用重叠延伸PCR连接片段为什么不出目的条带？
用重叠延伸PCR连接片段为什么不出目的条带？第一次P完有目的条带，但是很浅，做完胶回收，以回收后的片段作为模板再P，几乎没有目的条带，且杂带特别亮。这是什么原因啊？目的条...
用重叠延伸PCR连接片段为什么不出目的条带？第一次P完有目的条带，但是很浅，做完胶回收，以回收后的片段作为模板再P，几乎没有目的条带，且杂带特别亮。这是什么原因啊？目的条带大小约为3000多，期间试过改变退火温度和引物浓度，都没有效果！！！
求大神解答 感激不尽
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2个回答
2017-06-12 · 专注各类elisa试剂盒、血清抗体
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因为概率太低了,建议你程序先设置成五个循环94,68,72,时间自定,然后再接正常的PCR循环30个overlapping有好多种做法呢，你试试看不用取出反应液的办法吧，就是我回答里的那五个循环 首先 ，配置体系，酶和引物都加，然后，把第一步所得的三条片段尽量等浓度混合，量大一些，当做模板。 然后，设置双重循环的PCR程序，先按我说的，68℃那个，五个循环，专门连接他们的缺口； 接着是普通的PCR了，退火时间，最好设置成一分钟，延伸时间设置成五分钟，三十个循环。 接下来你都会啦~~ 我的建议是，配100微升体系哈，这三个片段，如果第一步PCR产率一样的话……胶回收用20微升溶解，各取10微升总共30微升做模板！ 这样如果你的引物特异性好的话，没问题的一定能做出来 特异性不好的话，果断重新设计。比如我师兄的引物，就很不好。
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我先试试，非常感谢你 么么哒
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研载生物科技（上海）有限公司_
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最后问题解决了吗？
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解决了谢谢
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