Question

荧光素酶报告基因的技术流程

Answer 1

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

Answer 2

1. 启动子的预测

2. 转录因子的预测

3. 报告基因质粒的构建

4. 实验方法及结果分析 

   
   

1. 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

2. 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。

3. 筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

4. 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

5. 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。

6. 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

7. 提取蛋白并用于荧光素酶检测。

8. 加入底物，测定荧光素酶的活性。

9. 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。