（1）温度：大部分
限制性内切酶最适反应温度为37℃，少数酶高于或低于这个温度。
（2）时间：合适，大多为1h，可过夜反应。
（3）溶液体系：要求有稳定的pH环境。（4）盐离子浓度：不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同要求。
（5）反应体积和
甘油浓度：在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。
（6）DNA的纯度和结构：DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。
