Question

提取RNA相关

Answer 1

最近要提取组织RNA，上网看了下其他前辈的经验贴，现将丁香园“丁香师兄”的经验贴整理如下。原文链接 https://www.biomart.cn/experiment/443/448/2282643.htm ，有删减

--自己的一些经验--
之前都是在提细胞的RNA，用量一般是细胞瓶/6孔板的一个孔用1ml，12/24孔板用0.5。
彩艳姐的意思是，这个用量是足够多的，一般就按照这个量来加就可以了。后续异丙醇等按照trizol的用量来加。
操作过程中都是无酶的用具，冰上操作。

看完了丁香师兄的protocol和经验，发现了自己之前忽略的几个点：
①防止内源RNA酶的降解很重要，细胞要放在冰上，组织在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化冻
②足量trizol可防止组织中内源性RNA酶降解RNA，充分研磨对于防止RNA降解也是类似的道理
③最后一步酒精洗涤可多加，充分反应，把RNA弹起来

关于配套试剂

Trizol 法提取 RNA 是要用到氯仿、异丙醇和乙醇的。氯仿遇光易分解，异丙醇虽然没有特殊说明，但我查的据说也是最好避光保存，不过这种试剂都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光线了。

关于实验时的防护：

RNA 很容易降解，所以实验时一般都要求口罩帽子的，避免组织的污染。不过以我的经验，好像内源性的 RNA 酶才是最主要的，也就是组织内本身的 RNA 酶。开始我是很小心，但是提取出来发现还是降解了，后来有经验了，即使组织掉在地上，拿回去继续提也没问题（前提是不能化冻）。所以最最重要的是组织在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化冻，这也是 fast200 法提取效果不好的原因（fast200 法一般不用液氮研磨）。

关于液氮研磨

万事开头难，液氮研磨是最开始的步骤，也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮，毕竟是零下近 200 度的东西，当然不是闹着玩的。不过只要小心操作，一般没啥问题，我提了一个多月的 RNA，对液氮是很亲切了，呵呵。我是找了一个保温杯，倒出一些液氮，然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮，组织会慢慢变脆，就会好研一些，对于一些含水量比较大，很硬的组织，我是准备了刀片，切成小块后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样 Trizol 才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol 内含 RNA 酶抑制剂）。

关于组织量

研磨前最后称一下组织的重量，毕竟 1 ml 的 Trizol 最多只能裂解 100 mg 的组织。 Trizol 里面是含有 RNA 酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol 无法完全浸润组织无法完全裂解组织，多余组织内的 RNA 酶等物质会导致 RNA 的降解。这是 RNA 降解的很重要的原因。

关于提取步骤

标准 Trizol 提取步骤为 液氮研磨--加入 Trizol 裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。

因为提取的组织，在加入 Trizol 后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入 Trizol 后，可以将裂解液放到-80 冻存半小时以上，据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和 RNA。我试了一下，的确有效果。

关于个步骤的时间

标准的时间是：

a. 液氮研磨（没时间要求，只要组织不化就好, 我一般一个组织十分钟左右，女孩子可能时间长一些，毕竟体力活）

b. 加入 Trizol 裂解 5-10 分钟（我觉得还是 10 分钟比较好，有人说这步要放在冰上，但是我的经验室温就可以，室温更有利于 Trizol 完全发挥作用，而且毕竟 Trizol 含有 RNA 酶抑制剂，不用担心 RNA 降解）

c. 加入氯仿室温静置 15 分钟（国产试剂真是坑爹啊，说明书把这步时间缩短到 3 分钟，出来效果奇差）

d. 离心 15 分钟，这是管见的一步，离心后分成三层，RNA 在上清里，所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻，切忌吸取太多，少量即可，洗到 400-500ul 就 OK 了，再多就容易碰到下层沉淀了。

e. 加入异丙醇静置 10 min，然后离心 10 min。

f. 用 75% 酒精洗涤沉淀，帮助分离剩余的有机试剂（剩余有机试剂过多会影响 OD 值和 PCR反应），所以酒精尽量多加一些，一般说明书没有说明这一步的时间，只是说剧烈涡旋震荡，我的经验是一定把沉淀弹起来，让浮在酒精中，然后放 1-2 min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。

g. 加入 DEPC 处理水，组织提取出来的量还是挺大的，虽然不是很纯，所以溶解液还是不能太少，至少要 50ul，之前一个大姐给我说加 20ul 就可以，结果浓度直接高得光度计测不出来了。而且浓度太高跑电泳时也跑不开，没法鉴定。