Question

基因工程的基本过程主要包括哪些?

Answer 1

基因工程的基本过程主要包括以下几个步骤：
(1)目的基因的获得
目前获得目的基因的主要方式有：化学合成法和构建基因文库法。
① 化学合成法
该方法适用于已知核苷酸序列且相对分子质量较小的目的基因的制备。目前化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150~200bp, 而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸片段适当连接并组装成完整的基因。目前成熟的全基因合成方法可以合成10~50kb长度的DNA片段。
② 构建基因文库法
基因文库(gene library) 是指含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克降群体。通过构建基因文库可以储藏和扩增某一生物的基因组片段，同时可以在需要的时候从库中调出所需的目的基因。
(2)目的基因与载体结合
基因工程的核心是将目的基因用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA.上,形成重组DNA。根据目的基因片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质，可采用黏端连接法或平端连接法。
①黏端连接法
一般选用对载体DNA只具有唯一切割位点的限制酶将载体DNA水解成具有黏端的线性DNA分子，然后再将目的DNA也做同样的限制酶水解，之后将两种纯化的水解产物混合并加入DNA连接酶，给予合适的条件，两者即能连接形成重组DNA
③ 平端连接法
如果参与重组的DNA两端是平端可以用T4噬菌体连接酶进行连接,但连接效率较低;如果参与重组的DNA一端是平端，一个是黏端，或者两个黏端不匹配，就需要用S1核酸酶将DNA的黏端修饰成平端，然后再进行连接。如果要增加连接效率，可以将平端DNA加工成具有黏端的DNA分子，再进行连接。
(3) 目的基因导入受体细胞
①转化
转化的方法是利用一定浓度的氯化钙溶液处理细菌，使带有目的基因的重组质粒进入到宿主细胞中的过程。
②转导
转导是指借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上的方法。
(4)转化体的筛选与鉴定
常见的筛选方法:遗传学检测法、报道基因检测法、核酸分子杂交法、核酸序列测定法、物理检测法和免疫化学检测法等。