Question

要获得一个基因的单克隆抗体，怎样设计实验方案

Answer 1

下面是通过原核表达系统得到基因表达的产物以及制备多克隆抗体的一种方法：
1.得到目的基因：设计引物（引物上带有酶切位点）→进行PCR,胶回收,酶切,再胶回收,得到带有粘性末端的目的基因→将目的片段连接到具有相同粘性末端的PET载体上
2．得到目的蛋白：将连接好的带有目的片段的载体转入到DH5α菌系中,将菌涂布与相应的抗性LB培养过夜→挑菌→接到相应抗性的液态LB中,摇菌过夜→提取质粒,进行PCR鉴定与酶切鉴定确定转入的不是空质粒→送测→将的到地带有目的蛋白基因的质粒转入到BL21（DE3）菌系中→诱导表达蛋白→进行SDS-PAGE检测是否表达出正确大小目的蛋白→大量诱导→得到表达蛋白的DE3
3.纯化目的蛋白：将菌进行超声破碎→引用Ni-His结合树脂4℃结合过夜→应用不同洗液洗脱得到纯化的目的蛋白→应用BSA对蛋白含量进行定量
4.应用得到的纯化目的蛋白150mg目的蛋白+弗氏完全佐剂对兔子进行一免,以后每次应用150mg目的蛋白+弗氏不完全佐剂加强免疫2-3次（两周加强一次）→最后一次免疫10天后采血→这样就制备得到兔高免血清
5.纯化抗体（可做可不做）：应用抗体纯化试剂盒对得到的血清进行纯化,得到纯化的兔免目的蛋白的多克隆抗体