Question

负染色技术的操作中的注意事项

Answer 1

一个理想的负染样品的图像应是均匀的，在一万倍的放大倍率下，图像出现一些薄薄的染色斑块，其特点是没有明显的边缘，染色斑由中央向边缘由深到浅，有一个逐渐变化的过程，如同中国水墨画的润色一样。在3～4万倍观察时则可见到反差良好而柔和的生物结构。而与此相反，黑白截然分明，缺乏由浅到深的中间色调，或在明亮的载网上出现颗粒性团块，则是染色失败的表现。因此，虽然负染色方法简单，但要获得理想的负染色效果和实验的重复性却不大容易。下列因素在操作中需加以注意：
悬液样品的纯度 待染色的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不要有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯。
悬液样品的浓度 样品悬液的浓度要适中，否则太稀时在电镜下寻找样品将很困难；太浓时，样品的堆集会影响观察。因此第一次制样时，同时用几种浓度的样品进行滴样，从而采用浓度适中的铜网进行观察。一般负染色技术通常要求每份样品至少含有10^7/ml目标颗粒，才能被观察到。
样品和染色液的均匀分布问题 生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜。使用其它支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不容易拍摄到好的照片。但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集，在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节。为了提高染色效果，需要设法促进样品和染料的均匀分散，可采用以下方法：
{使用分散剂} 常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液。方法是把0.005%～0.05%牛血清蛋白溶液加到样品悬液内，所加量无严格的规定，先加数滴，如果仍不见效可适当增加；也可以直接用0.01%BSA作为离心沉淀物的稀释液。此外，也可以用杆菌肽，按30～50μg/ml的浓度用蒸馏水配制成溶液，用作沉淀物的稀释液。或将样品悬液，PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样。 {亲水性处理} 对碳膜进行亲水性处理方法如下：把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa～1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性。用这种碳膜就不存在样品与染色剂凝集的问题。但要注意碳膜经亲水性处理后，经过1～2天又会变为疏水性的，因此最好亲水性处理后立即使用。 样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响。为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2%醋酸铵或硫酸铵作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜。
染色液的酸碱度不仅影响到染色液的扩散，而且会对病毒的形态造成一定影响。负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果。某些负染色剂及其pH的参考值见表：
某些负染色剂及其pH参考表 负染色剂 浓度（%） pH值 缓冲液 磷钨酸钾 2 6.0~7.0 醋酸铵 醋酸铀 0.1~1 4.0~5.2 无 甲酸铀 0.5~1 4.0~5.2 无 钼酸铵 2~3 6.0~8.0 醋酸铵 钨酸锂 2 6.0~7.5 醋酸铵 硼酸钨钠 2 5.5~7.0 无 不同的样品要求不同的pH值，因此，在具体应用时，不要生搬硬套，而应当做必要的摸索。
染色的时机
染色的时机十分重要。滴染色液的时机一般既不要在生物样品完全干了之后，更不应在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色。恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液。如果载网上尚有悬液残存时就进行染色，或者完全干后再染色，效果都不佳。
负染色引起的缺陷
负染色的应用，尤其有助于用电镜研究小的、游离的悬浮物，如病毒，细胞器，如叶绿体，线粒体等。负染色方法染色本身，染色液的溶剂、离子组成、亲水性、pH值和干燥情况的变化都可引起缺陷。一种比较常见的缺陷是表现为白色的小球（图\ref{Fig-Negtive-Flaw}）。在进行病毒形态鉴定观察分析时，这种小泡的存在很容易误导，尤其很容易被当作球状病毒。一般样品中的悬浮介质或染色液的pH值偏低时比较容易导致这种缺陷发生。
样品的亲水性，也很容易形成负染色缺陷。当样品亲水性差时，负染色结果经常显示背景差，且样品浓度等得不到真实的显示，引起误解。这时对样品吸附介质，如Fomvar膜进行亲水性的处理，如喷碳、离子蚀刻或采用新鲜制备的铜网等都会改善这种缺陷。
某些结构，如线粒体基粒、核糖体和蛋白质及其组装成的纤维甚至病毒等，可以通过负染色（negative staining）电镜技术观察其精细结构。其分辨率可达1.5nm左右。负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经过自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。