Question

寻采用不同比例的淀粉的发酵液培养枯草芽孢杆菌进行发酵最佳工艺

Answer 1

实验菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)1．210；D53、D56：从活性污泥中分离得到。
培养基的配制
斜面培养基(营养琼脂)：蛋白胨1％，NaC1 0．5 D／0，牛肉膏0．3％，琼脂2％。液体营养肉汤培养基：蛋白胨1％，NaC1 0．5％，牛肉膏0．5％。
淀粉酶试验培养基：在营养琼脂培养基中加2％的可溶性淀粉即成。
以上3种培养基的pH值均为7．2～7．4，分装后121℃灭菌20min。
产淀粉酶发酵培养基：玉米粉8％，蛋白胨0．5％，豆饼粉4％ ，K~HPO 5％ ，(NH4)2SO 0．4％ ，pH值自然，0．05MPa灭菌20min。
试剂与仪器设备
试剂：革兰氏染色染色试剂，Taq E，dNTPs(4种脱氧核苷三磷酸)，6x loading Bufer，50x TAE(用时稀释成lx TAE)，引物片断：27f5’一agagttgatcctggctcag一3’，1492r5’．ggttaccRgttacgacf一3’，引物浓度：1OD稀释至10001~L，琼脂糖，Goldview(用于替代EB的染料)，D2000 DNA Maker。
仪器与设备：DYY．III33B型电泳槽，MJResearch．PTC．200PCR仪，灭菌锅，离心机，37％ 恒温培养箱，水浴锅。
取样、富集培养
取样时将水和污泥一起取来，静置使污泥沉降，待污泥沉降后直接用灭菌过的移液管吸取1．0mL上清液，注入无菌水中，稀释适宜的倍数，以无菌操作注入固体培养基平板中。倒置放入生化培养箱中，37％富集培养24h-36h。
菌种的鉴定
形态学观察：取少量菌种制成玻片，通过革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态特征。生理生化鉴定：根据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定。16SrRNA同源性比较：取菌株D53、D56的48h的平板培养物为模板，配制50 L地体系，进行PCR扩增。
PCR反应体系：ddH2O 381~L，10×Taq E Bufer 5 L，dNTPs(2．5mmol／L)41~L，引物1(27D1 L，引物2(1492r)1IxL，离心混匀，分装。再分别加入模DNA O．5 L，TaqE(5U／~L)0．51xL，离心混匀。
制胶：l％琼脂糖(1g琼脂加100mL 1×TAE(电泳缓冲液))，再在lOOmL琼脂糖中加1 L～2 LGoldView。
电泳缓冲液：l×TAE倒入电泳槽中直至没过胶面并高出3～5mm。
点样：6xLoadingBufer(点样缓冲液)llxL，DNA51xL。
电泳：点好样后，设定电泳条件：电压150V，30min。
PCR反应条件：94℃、5min；(94℃、1min；52℃、1min72℃、2min)25个循环；72℃、10min，4℃ 保温。
PCR产物经脱盐纯化后，由北京华大中生科技发展有限公司进行测序，要求双向测通，将拼接后的测序
结果输入、 州．NCBI．nlm．nih．gov，利用BLAST软件，将测定得到的基因序列与Genbank数据库的序列作比对分析，进行同源性比较。
分离菌株的产淀粉酶透明圈试验
按参考文献[8]方法分别将D53、D56斜面菌株接入养肉汤液体培养基的试管中，37％培养24h后，分别划
线接种于淀粉酶试验培养基中，作2个平行。通过稀释菌液以使在平板上出现单菌落。将接好的平板置于37~C恒温培养箱中培养24h，取出后分别滴加现配制的路哥氏碘液，全部漫过平板，放置片刻，即可对其透明圈进行观察和测量。
菌株产淀粉酶粗酶活的测定
酶活力定义：lmL酶液于60％、pH6．0的条件下，在1h内催化2％可溶性淀粉成为糊精的克数为1个酶活
力单位。
将保存在斜面的菌株，分别接入发酵培养基中，37％、200r／min培养44h后，分别取发酵液测定酶活。