Question

【高分急求】免疫印迹和免疫共沉淀结果图分析

这是一张免疫印迹与免疫共沉淀的结果图 。。第一次拿到这种图真心不懂得分析。。求大神帮忙。。考核中请速度。。

免疫印迹IB 免疫共沉淀IP
具体疑问。。
问题1、为什么第一个电泳图左边标了IP:Flag和IB：VSV？到底是IP还是IB的结果？
问题2:：IB:Flag里这么多条带都是什么含义啊。。
问题3：为什么要做细胞提取物(XT)的IB：VSV
问题4：IP和IB分别用Flag和VSV的用意是什么。。
问题5：IP:Flag、IB：VSV和IB：Flag（也就是说除了XT以外的）这三个部分（红框

）是对什么对象的分析。。为什么要分别作这个部分和XT的？

还有。。图C为什么IP和IB用的VSV或者Flag与图B就不同了。。XT有两条带说明什么。。

图片来源的文章是DAIZBP1 recruits RIP1 and RIP3 through RIP homotypic interaction motifs to activate NF-B

Answer 1

IB每次只能检一种蛋白，所以要检两种蛋白的话，就需要检两次，一次是用是VSV抗体，一次是用标签抗体Flag；IP是共沉淀，多种蛋白均是带Flag标签表达的，所以一个Flag可以检出多种蛋白。

分清Input和IP，再者就看用什么抗体IP。Input样品中有A和B蛋白，如果用A蛋白的抗体IP，A蛋白可以富集，在IP的样品中若同样可以检测到B蛋白的存在，说明A和B蛋白互作。

基本原理

将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下，使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上，并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

以上内容参考：百度百科-免疫印迹

Answer 2

先占坑。题主应该把图下的说明也一起放过来的。
问题1、为什么第一个电泳图左边标了IP:Flag和IB：VSV？到底是IP还是IB的结果？
答：IB每次只能检一种蛋白，所以要检两种蛋白的话，就需要检两次，一次是用是VSV抗体，一次是用标签抗体Flag；IP是共沉淀，多种蛋白均是带Flag标签表达的，所以一个Flag可以检出多种蛋白。
分析下图B哈，图B被分成3个部分，先看最上面的一条，意思是，RIP1、RIP2、RIP3、RIP4和cardif这几个蛋白都融合了一个标签蛋白Flag，用Flag的抗体做IP后，再用VSV的抗体做IB，所显示出的条带。可以看到，只用Flag标签蛋白抗体做IP，再用VSV抗体做IB是检不出VSV条带的；而用RIP1、RIP2、RIP3、RIP4和cardif这标签蛋白IP后再IB可以检到不浓度的VSV蛋白，说明了VSV与这5个蛋白有不同浓度的相互作用。图B中间的部分意思是，用flag标签抗体做IP后，产物用Flag抗体做IB有不同大小的条带，说明IP过程是成功地将Flag标签融合蛋白富集纯化的。有的条带不只一条，可能蛋白分解或抗体不特异吧。

哎呀，你这个太复杂，这样说实在太啰嗦，总之呢，你多看看图片的说明，多看看IP与IB的原理，很好懂的。
以上答案仅供参考，如有错误，概不负责，哈哈……

Answer 3

这位同学，你既然知道了原图的出处，就应该仔细分析一下文献。
在这篇文章里：HEK293T cells were transfected with the indicated VSV or Flag constructs. Immunoprecipitates and cell extracts were analysed by immunoblot.

问题1： IP，代表的是用该蛋白来沉淀，然后用IB的抗体来识别。

问题2：你要看原图，有不同载体的结构，那些条带是相对于不同载体所表达出的蛋白。

问题3：这个是作为加样对照，标示加样量是一致的
问题4：抗体比较好，容易获得，不用针对每一种不同的蛋白采用不同的抗体
问题5：用FLAG做IP，而IB出现结果，说明这两个融合蛋白是相互结合的，光有FLAG，没有RIP不结合。

还有的回答：因为这个图研究的是不同的融合蛋白（看原文），两个条带是因为有磷酸化的发生