Question

分光光度计如何绘制标准曲线

Answer 1

基本原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

Answer 2

分光光度法中制作标准曲线及影响因素

标准曲线是直接用标准溶液制作的曲线,是用来描述被测物质的浓度(或含量)在分析仪器响应信号值之间定量关系的曲线。在分光光度法分析中,被测物质的浓度在仪器上的响应信号值在一定范围内呈直线关系,水样测定的结果可以从标准曲线上查出。因此标准曲线制作的好坏,将会影响测定结果的准确度。1标准曲线的表达式标准曲线应是一条通过原点的直线,如果坐标上各浓度点基本在一条直线上可不进行回归处理,但在实验中不可避免地存在测定误差,往往会有一、二点偏离直线,此时可用最小二乘法进行回归分析,然后绘制曲线,通常称为回归直线,而代表回归直线方程叫回归方程,表达式为:y=bx+a(式中:b为直线斜率,a为y轴上的截距,x为被测溶液的浓度,y为吸光度,是多次测定结果的平均值)。在实际工作中,制作标准曲线的目的,是要借助它来查出水样中被测物质的浓度,而不是由x值通过回归方程去求得最可靠的y值,为了便于将观察到仪器响应信号值代入回归方程中直接计算试样的浓度或含量,勿需去绘制标准曲线再从曲线上查出被测物的浓度,改用下式计算;x=by+a(式中:a为x轴线上的截距,其它解释同前)。2标准曲线的参数标准曲线有3个参数,即相关系数r,斜率b
绘制标准曲线的意义
以某一特定波长条件下由分光光度计分别测出一系列不同溶度标准溶液然的吸光度值，以吸光光度值为纵坐标，相应的溶液浓度为横坐标，在坐标纸上可作出一条吸光度与浓度成正比通过原点的直线，称作标准曲线。~~~绘制标准曲线的实用意义就是只要测得其吸光度值即可在标准曲线上查出相应的浓度值。。

Answer 3

物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---比耳定律。
本仪器是可见光分光光度计，其波长范围为360
nm～800
nm，具有测量被测溶液透光率（t）值，吸光度(a），浓度直读，模拟信号输出等功能。分光光度技术主要是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是lambert和beer定律。
使用方法：
（1）仪器预热。打开样品室盖（光门自动关闭）。开启电源，指示灯亮，仪器预热20
min。选择开关置于“t”旋钮，使数字显示为“00.0”。
（2）旋动波长手轮，把所需波长对准刻度线。
（3）将装有溶液的比色皿放置比色架中，令参比溶液置于光路。
（4）盖上样品室盖，调节透光率“100％t”旋钮，使数字显示为“100.0t”。（如显示不到100％t，则可加按一次。
（5）吸光度a的测量：仪器调t为0和100％后，将选择开关转换至a调零旋钮，数字显示应为“.000”。然后拉出拉杆，使被测溶液置入光路，数字显示值即为试样的吸光度a。
（6）测定完毕后，先打开样品室盖，再断电源。比色杯应清洗干净后，再贮放保存。
（7）浓度直读
按mode键，使conc批示灯亮，交已标定浓度的溶液
移入光路，按下溶液调节键（↑100％t键的↓0％键），使数字显示为标定值，将被测溶液移入光路，即读出相应浓度值。
（8）仪器数字显示背后，装有接线柱，按下func键，可输出模拟信号

Answer 4

标准曲线的作法
(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。
(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。
(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。
①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。
在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。
②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。
③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。
④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。
⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。
⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。