Question

[转]如何阅读分析质粒图谱

Answer 1

一个合格质粒的组成要素1. 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。2. 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+3. 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段4. P/E 启动子/增强子5. Terms 终止信号6. 加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。1. Ampr 水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。2. tetr 可以阻止四环素进入细胞。3. camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。4. neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418(长那霉素衍生物)失活5. hygr 使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号1. 启动子-促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。2. 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序列。