Question

动物细胞传代顺序

Answer 1

动物细胞传代培养的操作步骤

1.观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。
2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3.打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。
4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。
9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。
13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

Answer 2

传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。本实验以传代大鼠骨髓充间质干细胞为例进行细胞传代的步骤做一介绍。

一、传代前准备

实验开始前，将无菌培养瓶、15ml 离心管、移液管、枪头等放入无菌超净工作台，紫外线照射 30min，以进行工作台的消毒。

倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

从培养箱中取出待传代的细胞，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基。PBS缓冲液洗去残留的旧培养基,重复洗两次。

弃去 PBS,按每 25 平方厘米 1ml 消化液比例加入消化液，消化液中 EDTA 浓度视不同细胞而定，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，

可提高 EDTA 浓度的方法，本实验采用0.25%胰蛋白酶加 0.1%EDTA 的消化液证明可以很好地消化，并不会损伤细胞。放入显微镜

下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入 6ml 细胞完全培养基终止消化。消化时间为 1-5 分钟，具体依细胞而异。

采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的 15ml 离心管内。每分钟 800 转，室温离心 5min。

三、细胞传代的步骤-制备细胞悬液及培养
吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基。吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡。

显微镜下观察细胞分散情况，避免出现细胞成团情况，确定为单细胞悬液方可进行下一步操作。本实验以 1:2 的比例进行分瓶，通常骨髓充间质干细胞一般以 1：3 传代，传到第 3 代时，骨髓干细胞的纯度可达 95%以上。将培养瓶放入 37℃，5％CO2 的培养箱内继续培养。

四、结果观察

第二天可观察细胞贴壁生长情况，细胞培养换液时间一般为 2～3d，根据细胞生长的状态和实验要求来确定。待细胞铺满器皿底面，即可使用，也可继续传代扩大培养或换成维持液。

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。

当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心 3 分钟，弃上清，加入约 2ml 培养液，吹打至均匀，滴加 2-3 滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养。