Question

减少PCR产物中引物二聚体的方法?

Answer 1

PCR反应过程中产生引物二聚体是做PCR的各位战友经常遇到的问题，下面介绍一些减少引物二聚体的方法：

1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；

2. 可能模板有问题；

3. 模板浓度过小，适当加大模板量；

4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体；

8. 增加循环数；

9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；

11. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。