Question

在植物组织培养中，微生物污染的途径主要有哪些

Answer 1

防止污染的主要措施是：

(1 )改善环境条件。接种室与培养室要定期做好消毒与净化，接种前工作台或接种箱要开紫外灯30min以上。培养室的相对湿度应控制在70％左右，相对湿度太高时可以用抽湿机抽湿。

（2）接种人员的培训很关键，应严格执行无菌操作，对接种中所需的工具，必须经严格灭菌后才能使用。在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待用材料，避免气流被挡住。还要定期检查超净工作台的工作质量[8]。
(3 )严查接种材料。淘汰被真菌与细菌污染的接种材料。

（4）经常检查消毒锅的灭菌质量，若发现问题要立即检修。消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅，因冷热空气作用产生的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应待锅内稍冷却后才出锅[9]。

（5）检查培养容器是否存在问题。培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。林盛等配制了一种“4号消毒液”对培养瓶瓶口进行消毒处理，可以把培养基污染率控制在0.3％以下[10]。
3 继代培养中污染的防治
初始阶段所获得的无菌材料理论上是无菌的，但在后期或继代培养中也会出现污染，这除了操作不慎带菌外，继代材料在培养室也可能被螨传播的真菌污染。这类污染可从两方面防止：（1）扩大繁殖时应有合理的程序。在获得了最初的无菌培养物之后应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再提供给大规模生产。（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止[3]。许婉芳等将多菌灵用于金线莲组织培养的抑菌促生长，效果明显优于甲霜灵、甲基托布津及混合物，在含有多菌灵的培养基中生长的金线莲，不受微生物污染，灭菌率达100%，无白化苗，苗健壮[11]。

对植物中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消除，有时在外植体的初期培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被肉眼察觉，随着继代次数增加，菌量逐渐累积发展，才在培养基上显现出来[12]。黄小荣等则认为植物组培中细菌污染的原因是休眠细菌芽孢萌发的结果[13]。可以通过在培养基中添加抗菌素、茎尖培养、降低PH值等措施防止和减少细菌等内生菌污染。

王亦菲等在彩色海芋快速繁殖至4～5代时，添加200mg/L的青霉素GK，能有效抑制内生菌的生长，且不影响繁殖系数[14]。翟建中等在长春蔓的组织培养中，对了抑制内生细菌 Xanthomonas sp.，使用链霉素的作用大于庆大霉素和头孢唑林钠，培养基中同时使用二种抗菌素，有利于防治细菌的抗药性，能较长时期地控制细菌污染的发展，但链霉素剂量增高，会对植物产生毒性[15]。

在培养基中添加抗菌剂，选择合适的浓度非常关键，浓度低了效果差而浓度高又容易对植物产生毒害，影响增殖或使培养的材料变黑，出现死苗、白化苗等。两种或两种以上的抗生素结合使用可以防治细菌的抗药性。抗生素和多菌灵等一般不耐高温，需要采用过滤灭菌，在生产中添加起来很不方便，而苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠等常用作食品中的防腐剂，能耐高温高压，在组培生产中使用比较方便。

植物材料中的内生菌也可采用反复茎尖培养的方法来脱除。因为致病菌在植物体内的分布是不均匀的，通过维管束传播，茎尖分生组织是不带菌的，通过反复的茎尖培养既可脱除内生菌又可脱病毒。

除了欧文氏菌属外，大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。在紫苑属、鸢尾属、蔷薇属植物组织培养中，将培养基的PH值由5.8调至3.9～4.3，可防止大量的细菌污染[7]。胡庆等用低PH值（3.10）水培并改善容器通气条件，能使严重细菌污染的绿巨人团块正常增殖，对单株的生长无害，可生根的苗的比例比常规固培要高，基本解决了遭严重细菌污染后仍能带菌生产的问题[16]。

对已污染的培养物，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多时间，也可切取较大的植株重新消毒接种。李春燕等用400或600万单位/L的青霉素无菌水溶液分别浸泡银白杨组培细菌污染苗60min或40min，可有效防治组培中的细菌污染。经处理过的苗继代培养时，不再重复出现细菌污染现象，且苗分化能力强，生根培养时，根系发达，移栽成活率高[17]。李颖等的实验研究证明，如果继代培养中只有真菌污染，采用3%的多菌灵无菌液浸泡0.5h以上即可，用无菌水冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接种都可消除真菌污染。如果在细菌污染和细菌、真菌同时污染的情况下，可采用 HgCl2消毒法，把污染的培养苗切割成较长的茎段作外植体，用自来水冲洗0.5h，再在超净工作台上用乙醇和HgCl2进行短时间的处理即可再度建立无菌苗培养体系[18]。

4 减少培养基中的有机成分
培养基中有机物的存在是污染产生的重要原因，去除有机物也是减少污染的一条途径。宋锋惠等在阿月浑子的组织培养中，除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等（保留肌醇）有机成分，经 2～3代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。原因是这些都是某些细菌生长的必需物质，除去这些有机物后，细菌无法生长发育，逐渐死亡减少[19]。由日本的古在丰树教授首创的植物无糖组培快繁技术则完全除去了培养基中的有机成分，输入可控制量的CO2气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变为自养型，因而植株长势良好，污染率明显降低[20]。由于去除了糖，组培苗由玻璃瓶内培养改为箱式大容器培养，也可以整个培养室作为培养容器，甚至不需要严格的无菌操作，也极少污染，这项技术至少在许多植物组培苗的促根阶段应用是十分成功的。
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口罩的阻尘效率的高低是以其对微细粉尘，尤其对 2.5微 米以下的呼吸性粉尘的阻隔效率为标准。因为这一粒径的粉尘能直接入肺泡，对人体健康造成的影响最大。纱布口罩，其阻尘原理是机械式过滤，就是当粉尘冲撞到纱布时，经过—层层的阻隔,将一些大颗粒粉尘阻隔在沙布中。对于一些微细粉尘，尤其是小于2.5微米的粉尘，就会从纱布的网眼中穿过去，进入呼吸系统。防尘口罩，其滤料活性炭纤维毡垫或无纺布组成，那些小 于 2.5微米的呼吸性粉尘在穿过此种滤料的过程中。