Question

限制酶切割时，限制酶的识别序列在整个基因里是不重复的吗？问题在下面

限制酶切割时，限制酶的识别序列在整个基因里是不重复的吗？怎么取出来是一段DNA片段呢？切完就一分为二的话，那就是一端可链，是怎么和质粒的插入位点两头连呢？

Answer 1

限制酶的识别序列在整个基因组里是会出现很多重复的，所以在一开始设计实验、确定所选择限制酶的时候就要做很多工作。

最理想的状况是能找到一种酶切位点，在目的基因的两侧都出现、但在目的基因内部不出现，这时候就可以用同一种酶同时切割两个位点、剪下来一段DNA片段。这种操作的另一个优势是在切割载体质粒的时候也只需要切一刀，就可以把目的片段连进去了。

如果找不到上述情况，也可以用两种不同的酶分别切割目的基因的两侧，这样也能得到一段DNA。这种情况载体质粒就需要用两种酶切两刀，中间切下来的部分舍弃，再连入目的基因。

在从基因组获得目的基因的时候不可避免会“脱靶”，即其它含有同样酶切位点的片段被切下混入目的基因产物中。出现这种情况时可以利用凝胶电泳、根据目的基因的大小提纯出目的基因。

Answer 2

一段DNA片段与载体连接，通常采用两用不同的酶对DNA片段和载体分别酶切，而酶切位点必须是在载体上唯一，且在DNA片段上没有。这样得到的是三个片段（DNA片段，两段载体片段），理论上是随机连接，但是在后期筛选时，会根据载体上含有的抗性基因筛选到最终想要的。

追问

为什么是两段载体片段？

追答

因为是两种不同的酶对环状载体酶切，得到两段。如果是一种酶进行酶切，就是一条