Question

DNA重组技术怎样操作的？

Answer 1

DNA重组技术步骤如下：

一、质粒DNA
提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。

二、制备重组DNA
1. 在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2. 在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3. 反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4. 将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5. 将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中，加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。

三、转化感受态细胞
1. 制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2. 在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

实验结果
过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。