Question

买好引物直接合成还是要设计

Answer 1

要设计。
引物设计原则：1、引物长度：15-30bp，常用21bp左右。
2、弓|物扩增的跨度：以200-500bp为宜，（具体的长度根据实验目的设计）。
3、G+C含量以40%-60%为宜G+C太少，扩增效果不佳，太多易出现非特异性条带，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免弓|物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体产生非特异的扩增条带。
5、引物3’端的碱基应该严格要求配对，特别是倒数第I二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7、引物的特异性，引物应该与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
8、引物量：每条引|物浓度0.1-0.5μM以最低弓|物量产生所需要的结果为好，弓|物浓度偏高会弓|起错配和非特异性扩增，且可增加弓|物形成聚体的机会。