Question

你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的？需要哪些必备药品？还有用水平电泳可以吗？

Answer 1

我把我们实验室的实验讲义发给你，供你参考。
你做的应该是蛋白质的电泳吧，只能用垂直电泳。水平电泳用于分离DNA或RNA。

实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白

1．目的
学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。
2．原理
蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，饭盒。
4．试剂
SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。
5．实验准备
1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL，4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚蓝 0.5mL，b-2-巯基乙醇 1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放）；5´电泳缓冲液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）；
6．操作步骤
（1） 将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。
（2） 用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入容液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！
（3） 将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。
（4） 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（观察教师的演示）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。
（5） 配制10%分离胶。按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：

Acrylamide-bis 3.96 mL
1M Tris PH8.8 4.38 mL
d.d Water 3.432 mL
10% SDS 118.8 mL
TEMED 9.9 mL
10%APS 118.8 mL
（6） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。
（7） 配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：

Acrylamide-bis 0.675 mL
0.5M Tris pH6.8 0.563 mL
dd water 3.165 mL
10% SDS 45 mL
TEMED 7.5 mL
10% APS 45 mL
（8） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。
（9） 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。
（10） 选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20mL 蛋白分子量，其它槽中加入10～20mL自己制作的样品。
（11） 加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。
（12） 接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约2~3h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。
（13） 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。
（14） 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。
（15） 染色2h后，在将染液倒回瓶子里以备重复使用。在饭盒里倒入脱色液，过夜。
（16） 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否是预期的基因产物。
（17） 清理桌面，写实验报告。