Question

如图1为某种质粒表达载体简图，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，小箭头所指分别为位于tctR

如图1为某种质粒表达载体简图，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，小箭头所指分别为位于tctR上的限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，P为启动子，T为终止子（转录终止位点），ori为复制原点．已知目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI的酶切位点．（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______种．（2）用上述由两个DNA片段之间形成的连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞在适宜环境下共同培养，然后接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是载体--载体连接物．若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是______．（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是启动子，其合成的产物是______．（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是______．德国科学家最近培育出一种可以生产乙肝疫苗的转基因胡萝卜，通过生吃或者榨汁食用，就可以达到接种疫苗的效果，简便易行．但科学家表示，该方法还需进一步试验来验证疫苗疗效．如图2为乙肝疫苗的转基因胡萝卜生产部分过程的示意图．（5）a、b过程在遗传学上称为______、______，b过程需以mRNA为模板，______为原料，还需要的条件是ATP、______、DNA聚合酶等．（6）除了图示方法可以获取目的基因外，请你再写出一种方法：______．（7）基因在胡萝卜细胞内表达的过程分为转录和翻译，在基因工程的检测中分别用______、______方法．

Answer 1

（1）用EcoRI酶切出的目的基因和质粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA连接酶，则可出现3种连接结果，即目的基因自身连接形成的连接物，载体自身连接形成的连接物和重组质粒，要通过筛选、纯化才能选出符合要求的DNA．
（2）载体自身形成的连接物能重新形成完整的tet^R基因，具有抗四环素的特点，其他连接物中tet^R基因被限制性内切酶破坏，不再具有抗四环素的特点；在整个操作过程中，amp^R基因保持完整，载体（质粒）自身连接形成的连接物和目的基因-载体连接物（重组质粒）都具有抗青霉素的特性．
（3）RNA聚合酶与相关基因的启动子结合，完成的是转录过程，转录的产物是mRNA．
（4）将含有目的基因的靶DNA片段和载体分别用两个不同的限制性内切酶切割，使两种DNA片段自身的5′和3′黏性末端不同，但二者相同末端又互补，这明显减少靶DNA片段和载体自身环化与串连，使外源DNA片段能正确插入载体启动子下游．在本题中目的基因两端有EcoRI酶切点和BamHI酶切点，在质粒载体上也有这两种酶的切点，所以可以用这两种酶切出非同源性互补末端来阻止其他连接．
（5）由以上分析可知：a是转录过程，b是逆转录过程．逆转录过程需以mRNA为模板，脱氧核苷酸为原料合成DNA，该过程还需要的条件是ATP、逆转录酶、DNA聚合酶等．
（6）获取目的基因的方法有：依据蛋白质的氨基酸序列推测出DNA序列后人工合成、从基因文库中获取．
（7）在基因工程的检测目的基因是否转录形成mRNA，用的分子杂交技术；检测目的基因是否翻译形成蛋白质，用的是抗原-抗体杂交法．
故答案：（1）3
（2）目的基因-载体连接物、载体-载体连接物 
（3）mRNA?
（4）EcoRI和BamHI?
（5）转录    逆转录   脱氧核苷酸   逆转录酶
（6）限制酶切法（依据蛋白质的氨基酸序列推测出DN序列后人工合成、从基因文库中获取）
（7）分子杂交     抗原-抗体杂交反应