Question

RT -PCR的操作步骤

Answer 1

　1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例：
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（2） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。