Question

如何用生物素标记抗体

Answer 1

缓冲溶液的作用主要就是pH稳定性和离子强度的适合，还有避免缓冲溶液中的成分与样品分子发生共价链接，主要就是考虑这些。
链接很容易，就用EDC或者CMC等碳二亚胺，是最容易在羧基和氨基之间催化形成酰胺键，反应条件就是0到4度，过夜，用磁力搅拌子温和搅拌，pH<7反应快，不过pH=7或稍微pH>7也关系不大。EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高，而且一般的蛋白质的分子表面总有Lys,Arg,Asn,Gln，所以游离在分子表面的羧基和氨基总是不少的，参与反应的两种蛋白质用大致10：1的比例混合（哪种蛋白质便宜，哪种蛋白质的物质的量就大些，但是这不是全部原因），反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度（别用储存液的浓度）即可。很容易反应，而且EDC或者CMC等碳二亚胺是零臂连接试剂，用于空间位阻，形成多分子交联可能较小，即使形成了也很容易用分子筛层析按照分子量区分开。
参与反应的两种蛋白质用大致10：1的比例混合（哪种蛋白质便宜，哪种蛋白质的物质的量就大些，但是这不是全部原因），为了避免两种蛋白质之间发生交联成为串联，因为一种蛋白质形成串联的可能性低一些；即使要形成串联的蛋白质串珠，最好也不要是价格高的那种；另外，EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高，室温下即会催化，所以要在0到4度，过夜，用磁力搅拌子温和搅拌，一方面避免碳二亚胺催化活性太高形成串联的蛋白质串珠，另一方面，保护蛋白质不变性；反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度（别用储存液的浓度）即可，为什么？因为浓度高了更易形成串联的蛋白质串珠结构，浓度低了，没有反应成功，通过分子筛层析还可以分离出来接着连接，如果形成了酰胺键再要专一性切开就没有那么容易了。