Question

PCR产物的电泳条带不够亮,为何？如何优化PCR反应体系

我用的25微升的反应体系

Answer 1

首先要看你的条带是否清晰，虽然
亮度
不够但是清晰度应该高，没有
拖尾
没有非特异条带和
引物二聚体
，如果以上都没有，仅仅是目标条带不够亮的话，我觉得
你可以将25微升
体积
同比放大至50微升反应体系，相应的制胶的时候插孔槽用大梳子而不是小的那种。还有很重要的就是你的
核酸
染料是什么？我用过几种核酸染料感觉还是EB亮度最好，虽然
毒性
大了点。
如果条带不够亮，还有拖尾、非特异条带、引物二聚体等问题，那就是你反应体系中需要优化。1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上
特异性
差或者引物
浓度
过高，Mg浓度或酶含量过高（适当改变Mg浓度从1mM到3mM，
间隔
0.5mM进行
梯度
试验，或者酶含量改变按0.5U为间隔梯度试验。）2、如果出现拖尾，，要考虑引物特异性和模板
纯度
，另外
循环数
、
退火温度
以及Mg含量过高、dNTP过多等也可能造成拖尾。