Question

GST pull-down 技术原理及实验流程——钟鼎生物

Answer 1

GST-Pull Down 作为体外检测蛋白间直接互做的行之有效的方法，可用于证实预测的蛋白质-蛋白质相互作用的存在，也可用作未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛选测定法。（服务请咨询） 

GST-Pull Down的原理

  GST Pull-Down实验基于GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

GST Pull-Down实验方法

（基于钟鼎实验案例，验证预测的两个蛋白的互做）

实验设计

表1 Pull Down实验体系

编号 1 2 3 4

A-GST+--+

B-His-+-+

GST--+-

实验设计

1.IPTG诱导pET28a-B-His及pGEX-4T-1-A载体融合蛋白表达

1.1 表达载体转化至大肠杆菌Rosseta;

1.2 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中，37℃摇菌过夜，制备种子液;

1.3 次日按1:100接种于50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中，37℃摇至菌体OD600为0.8;

1.4 向菌液中加入IPTG至终浓度为0.5 mM，11~28℃摇床培养，诱导融合蛋白表达4~8h;

1.5 将菌液离心弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀，超声波破碎，离心取上清;

1.6 吸取少量上清用于SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

2.细胞破碎及蛋白纯化

采用超声破碎，GST柱亲和纯化及Ni柱亲和纯化，分别获得纯化后的目的蛋白。

2.1 GST柱纯化

（1）利用低压层析系统，细胞裂解上清液上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱;

（2）用GST Binding-Buffer冲洗层析柱，至流出液OD280值到达基线;

（3）用GST Elution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液;

（4）收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Tris-HCl透析过夜;

（5）进行SDS-PAGE分析和WB分析。

2.2 Ni柱纯化

（1）利用低压层析系统，细胞裂解上清液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱;

（2）用Ni-IDA Binding-Buffer冲洗层析柱，至流出液OD280值到达基线;

（3）用Ni-IDA Washing-Buffer冲洗层析柱，至流出液OD280值到达基线;

（4）用Ni-IDA ELution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液;

（5）收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Tris-HCl进行透析过夜;

（6）进行SDS-PAGE分析和WB分析。

3.GST-Pull Down实验

使用GST Protein Interaction Pull-Down Kit (购自Thermo公司)

3.1平衡树脂（GST）

(1)混匀Immobilized Glutathione，彻底重悬树脂;

(2)各取100 µL 50% 树脂悬浮液到4个离心管中，1250 ×g离心2 min弃上清;

(3)用500 µl PBS重悬树脂，1250 ×g离心2 min移除上清，重复3次。

3.2蛋白互作

(1)按照按照表1分别将A-GST蛋白和B-His蛋白加入到谷胱甘肽树脂中，将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜;

(2)1250 ×g离心5 min后，弃上清（上清要取净）;

(3)用500 µL PBS重悬树脂。1250×g 离心2 min弃上清。重复3次。

3.3诱饵蛋白和靶蛋白复合物的洗脱

(1)每管加入50 µL Elution Buffer;

(2)4°C 旋转混匀孵育20 min;

(3)1250 ×g 离心2 min弃上清，离心下来的液体置于冰上;

(4)取20 µL样品进行SDS-PAGE和WB检测。

钟鼎生物官网