Question

如何获得cDNA？

Answer 1

cDNA的获取方法：
1.用亲和层析法得到
mRNA
后，根据
mRNA
分子的
3'
端有
poly
(A)
尾结构的原理，用
12~20
个核苷酸长的
oligo
与纯化的
mRNA
混合，
oligo
（
dT
）会与
poly
(A)
结合作为反转录酶的引物，随机引物法合成的产物也是
RNA-DNA
的杂交体。把
cDNA
克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的
RNA
转变成
DNA
链，即形成双链
DNA
分子。
2.利用
cDNA
第一链的
3'
末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，用这种方法合成的双链
cDNA
在一端有一个发夹环，可以用单链特异的
S1
核酸酶切去。新合成的
DNA
存在切口，用
DNA
连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的
DNA
链。
RNase
H
法优于
S1
核酸酶法，它能获得包括
mRNA
5'
端全部或绝大部分的更长顺序
cDNA
分子。
cDNA简介：
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary
DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA(基因组DNA，genomic
DNA)不同而无内含子;相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。