Question

鉴别细菌的五种方法

Answer 1

Answer 2

细菌鉴定方法
1．生化鉴定
是细菌鉴定中最重要的一种，主要是借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对细菌进行鉴定，包括蛋白质分解产物试验、触酶试验、糖分解产物试验、氧化酶试验、凝固酶试验等。
2．血清学鉴定
适用于含较多血清型的细菌，常用方法是玻片凝集试验，并可用免疫荧光法、协同凝集试验、对流免疫电泳、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等方法快速、灵敏地检测样本中致病菌的特异性抗原。用已知抗体检测未知抗原（待检测的细菌），或用已知抗原检测患者血清中的相应抗细菌抗体及其效价。血清学鉴定操作简单快速，特异性高，可在生化鉴定基础上为细菌鉴定提供确定诊断。
3．分子生物学检测
适用于人工培养基不能生长、生长缓慢及营养要求高不易培养的细菌，检测方法包括核酸扩增技术、核酸杂交、生物芯片及基因测序等。常见的核酸扩增技术有聚合酶链反应、连接酶链反应等，主要用于耐甲氧西林、结核分枝杆菌等病原菌的检测。核酸杂交有斑点杂交、原位杂交等，用于致病性大肠埃希菌、沙门菌、空肠弯曲菌等致病菌的检测。生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片，主要是对基因、蛋白质、细胞及其他生物进行大信息量分析的检测技术。
4．微生物自动鉴定系统鉴定
可快速、准确地对临床近千种常见分离菌进行鉴定，目前已在临床实验室广泛使用。其中，细菌16S rRNA编码基因已成为较理想的基因分离靶序列，逐渐成为临床细菌鉴定、分离的金标准。
5．质谱技术
是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，用于分析细菌的化学分类和鉴定，具有高灵敏度和高质量检测范围的优点。主要是对核酸、蛋白质、多肽等生物大分子串联质谱进行分析。

Answer 3

在实验室中，主要是根据所用的鉴定仪器特点、感染性疾病的类型、标本种类、采集部位等因素建立具体的微生物学检验程序。大致步骤如下。
　　1．获得被鉴定菌种的纯培养菌落。
　　2．确定染色（革兰染色、抗酸染色）、形态和排列，按科、属、种依次鉴定下去。
　　3．运用知识、经验、最小数量的试验方法做出鉴定。
细菌鉴定方法
1．生化鉴定
　　是细菌鉴定中最重要的一种，主要是借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对细菌进行鉴定，包括蛋白质分解产物试验、触酶试验、糖分解产物试验、氧化酶试验、凝固酶试验等。
　　2．血清学鉴定
　　适用于含较多血清型的细菌，常用方法是玻片凝集试验，并可用免疫荧光法、协同凝集试验、对流免疫电泳、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等方法快速、灵敏地检测样本中致病菌的特异性抗原。用已知抗体检测未知抗原（待检测的细菌），或用已知抗原检测患者血清中的相应抗细菌抗体及其效价。血清学鉴定操作简单快速，特异性高，可在生化鉴定基础上为细菌鉴定提供确定诊断。
　　3．分子生物学检测
　　适用于人工培养基不能生长、生长缓慢及营养要求高不易培养的细菌，检测方法包括核酸扩增技术、核酸杂交、生物芯片及基因测序等。常见的核酸扩增技术有聚合酶链反应、连接酶链反应等，主要用于耐甲氧西林、结核分枝杆菌等病原菌的检测。核酸杂交有斑点杂交、原位杂交等，用于致病性大肠埃希菌、沙门菌、空肠弯曲菌等致病菌的检测。生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片，主要是对基因、蛋白质、细胞及其他生物进行大信息量分析的检测技术。

Answer 4

其实很简单，方法就是下文中所讲的第 4 条。快来看看鉴别细菌感染和病毒感染的这 5 种方法吧。
细菌感染与病毒感染是临床上十分常见的两种感染类型。
一般说来，感染性疾病的确诊主要依靠病原学检测，其缺点是检测过程太长，可能会耽误疾病诊治。而对于一些危重感染性疾病，必须予以紧急处理。
因此，临床需要一些简便有效的感染类型鉴别方法。笔者将鉴别方法整理成以下五步：
1. 看白细胞总数是高了还是低了？

一般来说，细菌感染白细胞总数升高，病毒感染白细胞总数降低。
其原因是致病细菌侵入机体后，在其趋化因子及补体活化产物的作用下，使吞噬细胞入血并向着感染部位移行集中，以此来和细菌作战，这样一个过程导致了白细胞总体上的升高 [1]。
而病毒感染机体后, 病毒释放或损伤细胞而释放出的毒性物质可引起炎性浸润。这种炎症浸润的细胞主要是单核细胞, 包括巨噬细胞、浆细胞与淋巴细胞。许多病毒如水痘、麻疹、脊髓灰质炎等, 虽被吞噬却不能被杀灭, 在细胞内生长复制, 引起白细胞的死亡 [1]。
故病毒感染与细菌感染不同, 多为白细胞下降。还有人认为: 病毒尚有对白细胞及骨髓有直接抑制作用, 这可能是病毒感染后白细胞减少的部分原因。
在这里强调几个特殊的例子：
一是伤寒杆菌感染机体后，白细胞总数是降低的。究其原因是伤寒杆菌产生内毒素, 可麻痹吞噬细胞, 阴止其移行, 同时在吞噬细胞内生长繁殖, 在致敏的淋巴细咆及其释放淋巴因子的杀伤破坏下, 造成靶细胞溶解, 导致白细胞减少。
二是临床上有些重症感染患者，因为感染较重，白细胞可能发生附壁，也就是贴附在血管壁上，这时血常规检测中的白细胞计数可以低于正常，其并不能完全反映外周循环的白细胞总数。这一类患者在经过治疗后，白细胞计数可以出现回升，即贴壁的白细胞又重新以游离形式出现在外周血中。所以针对这种情况，临床医生需要引起足够的警惕。
三是传染性淋巴细胞增多症以及传染性单核细胞增多症都是由病毒感染引起，白细胞总数都增多，分类是淋巴细胞或单核细胞增多。
2. 看降钙素原（PCT）和 C 反应蛋白（CRP）高不高？

降钙素原（Procalcitonin，PCT）是由甲状腺 C 细胞合成分泌的一种多肽，C 反应蛋白是由肝脏合成的一种急性时相反应炎性蛋白。
有研究表明，PCT 对细菌感染检测的敏感度为 92.7% ，特异度为 63.2%。CRP 对细菌感染敏感性 93.7%，特异度为 13.2%。PCT 对病毒感染检测的敏感度为 78.7%，特异性为 46.0%。CRP 对病毒检测的敏感度为 95.5%，特异度为 13.6% [2]。
另外，研究也发现细菌感染的 PCT、CRP 血清浓度明显高于病毒感染。健康人群血清中 PCT 水平通常处于很低的程度，约小于 0.0025ug/L，但却能稳定存在 [3]。Delevax 等发现 PCT 的血清水平大于 1.2 mg/mL 是细菌感染而且应开始抗生素的治疗的阈值 [4]。
关于 CRP，严格来说，其不完全是感染的观察指标，目前并没有一个可以参考的「阈值」用以界定细菌感染还是病毒感染。另有研究显示 [5]，与健康对照相比，细菌感染组 CRP 浓度升高明显，差异具有统计学意义，而病毒感染组患者 CRP 浓度升高并不明显，差异没有统计学意义。
3. 看痰色是脓性痰还是粘液痰？

有研究表明，脓性痰与细菌阳性率呈显著相关性 [6]。倪力, 张锋英, 高稚婷等的研究则进一步表明，黄脓痰组与白粘痰组相比, 痰及血中性粒细胞比例显著增高, 表明中性粒细胞量与白粘痰到黄脓痰的改变相关 [7]。而此前已有研究表明，细菌感染时患者主要表现为中性粒细胞为主的炎症反应，痰色的变化强烈地预示着患者可能存在着潜在的细菌感染 [8]。
由此，我们的观点是：脓性痰主要考虑细菌感染，粘液痰则考虑病毒感染、其他类型的感染或者疾病。
4. 看对药物治疗的反应如何？

细菌性感染对正确的抗生素治疗皆可显效，而病毒性感染则无效。
对于发热的患者，在使用解热镇痛类药物时，若系病毒所致上呼吸道感染，往往能得到暂时而明显的退热效果，同时全身性情况亦见改善。
但对细菌性感染如扁桃体炎等患者服同样剂量的解热镇痛类药物，退热效果差，全身症状亦无明显改善。
正是基于这一特点，编者才能准确判断出自己为病毒性感染。

Answer 5

细菌分离是指从临床发病动物组织脏器、粪便或者混杂微生物中获得单一菌株的培养方法。通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定，确定细菌种类。

一、实验前准备

1、实验物品准备

手术剪刀、酒精灯、接种环、镊子、灭菌平皿、手术盘、灭菌的棉签、酒精棉球、自封袋、记号笔等。普通恒温培养箱、无菌室和超净工作台。

2、培养基准备

根据所分离的细菌种类不同，选择不同种类的鉴别培养基，如大肠杆菌（麦康凯琼脂培养基或伊红美蓝琼脂培养基）、葡萄球菌（高盐甘露醇琼脂培养基或Baird-Parker培养基）、霉菌（马铃薯葡萄糖培养基或孟加拉红培养基）、沙门氏菌（SS琼脂培养基或HE培养基）、弧菌（氯化钠蔗糖琼脂培养基或TCBS琼脂培养基）、弯曲杆菌（改良Camp-BAP琼脂培养基或skirrow琼脂培养基）、鼻气管鸟疫杆菌（含有庆大霉素或多粘菌素的5%绵羊血液的琼脂平板）。

根据要分离的细菌选择培养基后，严格按照使用说明书用蒸馏水进行配置。注意在配置时一定要混合均匀后放入微波炉或使用万用电炉加热至沸腾。使用封口膜或棉塞进行封口（防菌），外层用报纸进行包装（防水），放入高压锅中进行灭菌。

将灭菌后的培养基和培养皿放入超净台中,待培养基不烫手时（60℃左右）将其倒入培养皿(提前标记好制作日期和培养基名称)中，厚度为3-4mm。配置三糖铁时，直接倒入灭菌试管中，以5ml为宜，倾斜放置，做成斜面。晾干、待其凝固后放入37℃恒温箱中倒置烘20小时。取出培养皿,自封袋封好放冰箱4℃保存,待检测时用(注：不要放太长时间，以免水分流失太多)。

3、病料的采集与保存

将送检的病鸡、新鲜死鸡直接打开腹腔，以无菌操作的方法，采取有明显病变部位的组织，直接放到灭菌的培养皿中（或一次性自封袋中），如病死鸡的肝、脾、心包、气囊膜、眼球液、腹水、关节渗出液及脓液、输卵管内容物等病料，立即进行细菌分离培养，如不能及时进行实验需将病料放到0-4℃保存待检，不得超过24小时。若24小时内未能进行实验，需将病料置-20℃保存。

4、接种方法

平板划线接种法

本法是最常用的分离培养细菌的方法，其目的是将混有多种细菌的临床组织或混杂菌液，经划线分离使单个分散生长形成单个菌落。

A、分区画线法：适用于含菌量较多的样品。

a、用接种环先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三区……依次用接种环划线。

b、每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。划每一区域时应接触上一区域的接种线2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。

c、划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。

B、连续画线法：适用于含菌量相对较少的样品。

先用接种环将病料或混杂菌液均匀涂布于平板培养基表面一角，然后用接种环自标本涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平行线。

液体培养基接种法

用棉签或接种环挑取病料或菌液，在试管壁和液面交界处轻轻摩擦，使菌混匀在液体培养基中。

倾注平板法

本法主要用于液体样品或稀释后的固体样品的细菌总数检测，如水中微生物数量检测等。

吸取用灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的样品稀释液1ml，置灭菌平皿内，倾倒以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15-20ml，混匀，待其冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。

穿刺培养法

此法用于保存菌种，观察某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物，插入固体培养基的中央穿刺至培养基2/3处，然后沿原穿刺线退回接种针。于37℃恒温培养箱中培养后观察反应情况。

5、染色方法

制片

a、涂片

取保存在酒精中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、染色类型。用接种环在玻片中央滴加一小滴无菌生理盐水，以无菌操作取单个菌落，在玻片上均匀涂抹；或无菌操作法用接种环取菌液1-2环，均匀涂布载玻片中央。（注意菌落涂片以肉眼无明显可见菌块为宜，菌液尽量涂开）。

b、干燥

涂片放在室温下自然干燥，也可将标本放在酒精灯火焰上方约10-15cm处烘干，以助水分蒸发。

c、固定

将已干燥的涂片向上，在酒精灯外焰处迅速通过2-3次，以不烫手背为宜，使得菌体与玻片牢固结合。

革兰氏染色

a、初染

在已干燥固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液（以覆盖整个菌层为度），1min后，水洗，甩干。

b、媒染

滴加革兰碘液于抹片上，1min，水洗，甩干。

c、脱色

滴加95%乙醇脱色并轻轻晃动载玻片，直至洗出的乙醇不出现紫色时停止（约0.5min），水洗，甩干，滤纸吸干残存水滴。

d、复染

滴加沙黄复染液或石炭酸复红溶液，1min，水洗，滤纸吸干后，备镜检。

e、结果

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

二、操作方法

1、无菌环境

打开超净台紫外灯开关，紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯，再打开风机10分钟。再将待检病料、培养基等物品放入超净台内。

2、病料处理

对疑似感染细菌的病变组织器官，应先用刀片灼烧组织或渗出物，烫灼组织表面杂菌，在烧灼部位打开1cm左右的切口，然后再用接种环或消毒棉签通过灼烧过的表面插入组织内取样，取样后进行划线接种。

3、接种培养

根据样品中细菌的多少选择平板划线方法，接种后，将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养8-12小时。

4、结果观察

12小时后观察菌落形态，初步判断可能的疑似菌。再用接种环挑取单个菌落进行染色镜检观察。