Question

已知酶切位点怎么获得基因

Answer 1

目前目的基因的获取方法主要有以下2类: (1)已知基因的获得:PCR分离法和化学合成法等 (2)未知基因的获得:直接分离法和基因文库分离法等 第一节直接分离法 1、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。 应用对象:适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较 少,获得也比较简单。 (1)对已定序列的DNA分子,只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割,分离纯化所需要的DNA片断,与 适当载体连接。 (2)对已知定位的目的基因,只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点,一次就可以获得。 (3)即使含目的基因的DNA分子未定序或定位,也只须通过酶切分析,随后再通过部分酶切,构建一个简单的基因文库,从 钩出目的基因。 2. 随机片断化 2.1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间,使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 2.2 机械切割法 (1)超声波 超声波强烈作用于DNA,可使其断裂成约300bp的随机片断。 (2)高速搅拌 1500转/分下搅拌30min,可产生约8kb的随机片断。 3. 物理化学法 基本原理:DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱基配对,其中GC间存在3个氢键、A T间存在2个氢键,如果不同基因片段 的碱基组成差异较大,其理化性质,如浮力密度和解链温度等也明显不同,采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的 基因的目的。 3.1密度梯度离心法 由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大,利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大 小分离开来。 然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验,分离相应的基因。 非洲爪瞻5SDNA和海胆组蛋白基因就是根据此 分离得到。
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