Question

基因工程中通常对表达载体在哪些方面进行修饰?

Answer 1

表达载体主要包括目的基因的启动子、用于选择的遗传标记和目的基因本身等方面。
首先，要选择合适的启动子并改进其活性，用以调控目的基因特异性表达。目前在基因工程中多采用特异性启动子，如组织特异性启动子，环境响应启动子及化学诱导启动子等，同时还要对特异性启动子序列进行加倍增强子序列。去除抑制子序列等改造，以最终实现在转录水平对目的基因进行定时、定位、定量表达的调控。
第二，表达载体必须载有遗传标记。这样才便于人们将具有目的基因的受体细胞识别和选择出来。常用的遗传标记有对某种抗生素的抗性，标记基因产物与特殊底物发生显色反应等。
第三，为使目的基因得到良好的转录、翻译，通常还需要对目的基因进行适当的修饰，以增强其表达效率。目的基因的修饰通常从以下3个方面入手。(1)添加5'和3'端非翻译序列。有实验表明，这能为核糖体提供了新的结合位点，增强翻译的活性。(2)优化起始密码周边序列。研究发现，真核生物起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高。实验表明，细菌的一个几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAuGG后，其在烟草中的表达水平就提高了8倍。(3)改造基因编码区。来自原核生物的目的基因在植物体内，因表达机制的差异造成mRNA稳定性下降，往往表达水平很低。例如来自苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低。美国Monsanto公司Perlak等人利用密码子的简并性，在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加GC含量，去除原序列中影响mRNA稳定的元件，结果在毒蛋白转基因植株中的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。