Question

影响核酸泳动距离的因素有哪些

Answer 1

1、核酸的性质
核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动 率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型>线性>单链开环型。

对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电 泳分离纯化单链核酸。

2、凝胶孔径的大小：
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段 （5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素，它决定了能被分离的 片段的大小。下表列出不同凝胶浓度与其分离DNA分子大小的范围。

凝胶
胶浓度（%）
线状DNA分子的有效分离范围
溴酚兰*
琼脂糖
0.3
5~60 (kb)

0.7
0.8~10

0.9
0.5~7

1.2
0.4~6

1.5
0.2~4

2.0
0.1~3

PAG
3.5
100~2000 (bp)
100

5.0
80~500
65

8.0
60~400
45

12.0
40~200
20

15.0
25~150
15

20.0
6~100
12
*指迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）
3、电场强度和电场方向：
低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的 迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨 力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电 场凝胶电泳分离极大片段的DNA。

4、电泳环境
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮 液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE 中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些 酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。

缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性 极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。

缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向 正极泳动。

在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更 强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。