多肽固相合成法的分析

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小可195
2016-05-27 · 超过49用户采纳过TA的回答
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分析HPLC使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
HPLC分两类:离子交换和反相。离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用,通过可变PH, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常,先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽从柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱,如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为G4-G8碳原子。由于洗脱是一种疏水作用。大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显著差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μm)和25×250mm(10μ m)。
大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸,稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3,醋酸钠/氨,TFA/TEA,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH,甚至微碱pH,因为这样会破坏柱子。
Fmoc―氨基酸的制备和侧链保护
Fmoc基团是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六环溶液中,理想的Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定,在酸性条件下脱除..

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