Question

常用于蛋白质多肽链N端.C端测定的方法有几种？基本原理是什么

Answer 1

(1)N-末端测定 　　A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。　　DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。　　B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法，步骤如下：　　由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸。　　C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物。　　丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。　　(2)C-末端分析　　A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。　　这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。　　B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。