Question

求助miRNA QRT-PCR引物设计

Answer 1

• miRNA引物设计（茎环法+染料法检测）
  
  设计方法：通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上。
  
  反转录茎环通用序列：
  
  GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC
  
  miRNA序列：
  
  >mmu-miR-99b-5p
  MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p
  
  CACCCGUAGAACCGACCUUGCG
  
  mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为：
  
  GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG
  
  定量PCR反向引物为：TGTCGTGGAGTCGGC
  
  正向引物为：CACCCGTAGAACCGAC
  
  备注：
  
  1
  定量PCR反向引物和正向引物的TM值不要相差太大，反向引物TM已经确定，如果正向引物TM较低，则在5`端添加几个碱基（如：G）。
  
  2
  染料法的检测可能会出现引物二聚体和非特异性扩增，可以使用探针法检测，探针法和染料法相似，只是茎环上不仅有一个反向引物结合位点，还有一个探针结合位点。