Question

细胞的冷冻和储存

Answer 1

细胞的冷冻和储存是细胞生物学和医学领域中的重要技术，它们对于保存细胞的功能和活性、以及未来的研究和治疗具有重要意义。以下是对细胞冷冻和储存的详细阐述：

一、细胞冷冻

细胞冷冻是将细胞在特定条件下进行降温处理，以达到长期保存的目的。冷冻过程需要严格控制温度、时间以及冷冻保护剂的使用，以确保细胞在冷冻过程中不受损伤。

1. 冷冻前准备

• 更换培养基：在冷冻前一日更换半量或全量培养基，以去除细胞代谢产生的废物，并观察细胞生长情况。

• 配制冷冻保护液：常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、甘油等，它们可以降低冰点、减少冰晶形成并保护细胞免受冷冻伤害。将适量的冷冻保护剂加入新鲜培养基中，混合均匀后置于室温下待用。

2. 细胞收集与离心

• 收集细胞：按照细胞继代培养的操作方法，收集待冷冻的细胞。对于贴壁细胞，需要使用胰蛋白酶等解离剂进行消化；对于悬浮细胞，则可直接收集。

• 离心：将收集的细胞悬浮液进行离心，去除上清液，以去除培养基中的杂质和细胞碎片。

3. 重悬与分装

• 重悬：在无菌条件下，向离心后的细胞沉淀中加入适量的冷冻保护液，轻轻吹打使其重新悬浮。注意在加入冷冻保护液时要避免产生气泡。

• 分装：将重悬后的细胞悬液分装至已标示完全的冷冻保存管中，每管体积通常为1ml左右。同时，取少量细胞悬浮液进行污染检测。

4. 冷冻过程

• 梯度降温：传统的冷冻方法是将冷存管置于4℃放置10分钟，然后转移至-20℃放置30分钟，再转移至-80℃放置16～18小时（或隔夜），最后放入液氮槽vaporphase进行长期储存。需要注意的是，-20℃的停留时间不可超过1小时，以防止冰晶过大导致细胞大量死亡。另外，也可以跳过-20℃的步骤直接放入-80℃冰箱中冷冻，但细胞的存活率可能会稍微降低。

• 程序降温：利用已设定程序的等速降温机进行冷冻，以-1～-3℃/分钟的速度由室温降至-80℃以下（通常为-120℃），然后放入液氮槽vaporphase进行长期储存。这种方法适用于悬浮型细胞和hybridoma的保存。

二、细胞储存

细胞储存是将冷冻后的细胞在特定条件下进行长期保存的过程。液氮保存是目前最常用的细胞储存方法，因为它提供了足够的低温来抑制细胞代谢和减少细胞损伤。

1. 储存条件

• 温度：液氮的沸点为-196℃，因此细胞需要在液氮中进行储存以保持其活性和功能。

• 容器：储存细胞的容器通常是特制的液氮罐或冷冻管，它们具有良好的保温性能和密封性以确保储存温度的稳定和防止污染。

2. 质量控制与监测

• 定期检测：在储存过程中需要定期对细胞进行质量检测，包括细胞的存活率、生长特性以及是否存在污染等。这可以通过细胞培养、流式细胞术和免疫荧光染色等技术进行。

• 记录与管理：建立完善的细胞储存记录和管理系统，详细记录每批细胞的来源、储存时间、储存条件以及质量检测结果等信息，以便于后续的追溯和管理。

3. 应用前景

细胞储存技术在医学和生物技术领域具有广泛的应用前景。例如，在疾病治疗方面，储存的干细胞可以用于组织修复和再生医学；在药物研发方面，储存的细胞可以作为药物筛选和药效评估的模型；在遗传病研究方面，储存的细胞可以用于基因诊断和基因治疗等。

综上所述，细胞的冷冻和储存是细胞生物学和医学领域中的重要技术之一。通过严格的冷冻和储存条件以及质量控制与监测措施可以确保细胞在储存过程中保持其活性和功能并为未来的研究和治疗提供可靠的细胞来源。

Answer 2

细胞生长时的表型会发生改变或漂变，所以细胞必须计数，计数后应马上冻存。

冷冻细胞前

1 检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。

2 确认有无菌的可用于冷冻的冻存管 。

3 确认液氮罐里是否有冻存细胞的位置。

冷冻细胞

1 将培养基中的细胞培养至对数生长期。

2 进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例高达20％以上的细胞。

3 决定冻存量，安排需要几个冻存管。

冻存细胞在融化时要稀释10 倍，而稀释后的液体是5X种子液。

例如：如果种子液的密度为5.0 X 105 个／ ml, 那么融化后重新悬浮细胞时细胞的密度为2. 5 X 106 个／ ml, 所以冻存细胞时的细胞密度为2.5 X 107 个／ ml 。

1 准备好冷冻培养基， 分装成1 ml, 冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。如果你不清楚用什么，那么就使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。

2 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。

3 每个冻存管中分装1 ml 冻存培养基，放置在冰上操作。

4 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60C 或更低温度的冰箱，放置16~24 小时。

5 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。

6 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。

液氮的使用

1 细胞常常保存在液氮罐或是液氮制冷柜中，但是要每隔几个星期补充液氮

2 自动填充液氮的罐子，必须定期检查，以保证管道的畅通以及液氮罐没有空掉。

3 在操作液氮罐内容器时要戴好厚手套，否则会冻伤手臂。

4 从液氮罐内拿出细胞时至少也应戴上乳胶手套

5 不要在液氮罐内悬吊物品，也不要吸入气化后的液氮，用手挥开液氮后，就能看见液面了。

6 戴好保护眼睛的眼罩，以免操作冻存管时，冻存管爆炸溅伤眼睛。

7 决不能把没有拧紧的管子放入液氮中，而且要提前找负责液氮罐管理的人员确定位置，不要乱放。

8 不要关闭警报，定期检查。

9 如果听到了液氮罐的报警声，立即通知实验室管理人员。如果是周末或凌晨，则先检查确认是否是由于液氮面过低或温度过高引起的报警，再联系负责液氮罐的人员。