Question

mtt实验原理

Answer 1

噻唑蓝，简称MTT。细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

药物MTT法实验步骤：

贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，每次加入细胞的枪头贴着96孔的四周，旋转缓慢加入，加入细胞后可前后左右水平摇晃几下，以让细胞铺板更佳。

2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上细胞贴壁后即可加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，一行12个孔，两个PBS填充孔，两个对照孔，两个空白孔，6个复孔

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6. 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。