Question

TA克隆正反向测序结果都找不到扩增目的条带的引物（载体通用引物也找不到）

TA克隆正反向测序结果都找不到扩增目的条带的引物（载体通用引物也找不到，互补序列都试了），请问这是空载么，但是和载体序列比对同源性也不高啊，那测出来的序列是什么？

注：目的片段PCR扩增我用的是简并引物，片段长1200bp左右，切胶回收后做的连接转化，拿给测序公司的检测引物是载体上的M13通用引物。
载体是PMD19-T，菌液PCR验证条带是1000多bp我才拿去测序的，验证引物是M13通用引物。

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Answer 1

poly结构可以尝试测序下去，应该没有太大问题，至于你说的引物问题，将已知的载体序列去掉开始那部分就应该是你的引物序列，因为是简并引物，所以只会出现一种引物情况，或者是你
PCR的时候，上下游的简并引物之间是不是特异性不好，所以出现不是你需要的扩增产物，你挑选的单克隆只是其中的一种，或者你挑选另外的单克隆试试

追问

非常感谢，用你的方法我找到正向测序的引物了，反向的如果还按这种方式的话，我想是错配的太多了，我简并引物22个碱基，有10个都错配了（简并碱基代表的可能碱基倒是没有错配），这种错误率，真是 手抖，而且整条序列poly结构出现太多次了，这条引物在这个感受态中与其他基因重组了？有没有这种可能？PS：测序公司两条引物都没找对，纯粹糊弄我呢。

追答

不知道你挑选了几个单克隆测序，你可以再挑几个试试。至于是否重组的问题，不知道你的PCR片断是获取的基因吗？如果是的话，有小的可能，毕竟T载体不是表达载体。

Answer 2

不知道测序公司给你的结果显示是无信号还是什么 如果是无信号的话你拿到的序列是测序仪随机产生的序列 你在网上比对序列是没有意义的
不知道你做了酶切鉴定了没有 有的时候光是菌液PCR鉴定是不够的 我八成分析你这个是空载了
友情提示一下 有的时候你测序会发现有一段自己的序列然后直接就是载体序列了也是有可能的 当插入序列PCR过程中产生环装序列有的时候是测序不到的 希望对你有帮助

追问

就测序清单上显示，正反向测序结果均为合格，但是他们告诉我说并没有测通，所以连不起来。说是我的序列有poly结构，我看了序列的确是有大概19个T连一起了；然后我问引物找不到该是什么问题，那边说帮我找，结果上游引物给拆成两段给不完全拼上了。就引物序列大概20bp的样子，还能拆了比对么？遇到这种序列有poly结构的话，还能测出来么？T. T