Question

引物是人工合成的已知目的基因的一小段核苷酸序列，人工合成引物时需要考量的因素是什么？

Answer 1

引物的作用是引导目的基因进行扩增的，而我们在设计引物时需要注意的细节有以下几点需要考虑的因素：
1、引物长度一般为15-30bp，最佳为18-25bp；
2、上下游引物GC含量一般为40%-60%，以50-60%为宜；
3、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是会导致错配；
4、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高；
5、引物和产物之间的Tm值相差别太大，一般为5℃为宜；
6、上下游引物及引物自身不能存在超过4个或4个碱基以上的互补，否则容易造成引物二聚体的产生。
7、扩增产物一般在100-200bp为最优，过长或过短都会降低扩增的特异性。
一般我们将序列输入到在线平台或者primer、oligo 上设计参数之后就可以进行设计了，然后从中选择分值或者网页上靠前的引物即可。
引物的好坏判断标准：扩增产物的特异性：解释一下熔解曲线峰值单一，扩增曲线呈S型曲线，Ct值在35循环以内，即是一对合格的引物。