Question

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

Answer 1

首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的 PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的 干扰更大，很容易造成测序失败。--------转自三博远志网站(测序FAQ)

Answer 2

这里有两个问题，pcr产物测序和pcr过短的问题
熟悉pcr产物测序原理就明白，前面20-30个bp测出来市数据是不准确的，测序范围大概是800左右，超过的需要双向测序。
过短的pcr产物，pcr测序肯定需要纯化的，如果太短的话，在胶回收的时候很可能影响pcr产物浓度。一般pcr送样测序的条件A未纯化PCR产物的要求，1. 片段大于200bp；2.请提供50ul PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ul样品，应该能够清晰的分辨出目的条带； 自带引物，引物浓度不低于5uM,并请注明。B纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；
2.浓度大于20ng/ul，体积大于10ul，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一； 自带引物
价格都不是很贵，一般能22-25元一次。

Answer 3

目前用的测序仪一般是基于PCR方法的sanger法原理，
那么用你的PCR产物为模板，测序引物从最两端开始，么测序时由于测序仪的毛细电泳管分辨率问题，测序引物后的50个左右长度碱基测不出。
测序仪通常从测序引物起延伸50个左右bp后，才能分辨，读出序列。

当然，如果你用第三代或第四代测序技术， 称为next generation DNA sequencing 或next next generation DNA sequencing，那么再短的PCR产物也能测出来。这种新的测序方法通常最长也就是测50到60bp。