Question

生物化学试题

已知一种无色溶液中含有ATP、AMP，请问：
（1）选用什么试验方法予以区分和鉴定？
（2）其原理各是什么？
（3）列出主要的仪器和材料？

Answer 1

在pH4.8电泳缓冲液条件下，带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP解离之后，带有负电荷量的顺序为：ATP＞ADP＞AMP，它们在电场中移动速度不同，从而得到分离。又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质，将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下，可见暗红色斑点，参照标准样品在同样条件下的电泳情况，对混合试样分离后的各组分进行鉴定。

三、仪器与试剂

1．仪器

（1）电泳仪、电泳槽（平板式）

（2）紫外灯

（3）电吹风、医用镊子

（4）醋酸纤维素薄膜（8 cm×12cm）

（5）微量进样器（10μL或50μL）

2．试剂

（1）柠檬酸缓冲液（pH4.8）：称取柠檬酸8.4g，柠檬酸钠17.6g，溶于蒸馏水，稀释到2000mL。

（2）标准腺苷酸溶液：用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成100mg/10mL溶液。其中AMP需略加热助溶。置冰箱备用。

（3）混合腺苷酸溶液：分别取上述标准液AMP、ADP、ATP各1份等量混匀。置冰箱备用。

四、操作步骤

1．点样：将醋酸纤维素薄膜放入pH4.8柠檬酸缓冲液中，待膜完全浸透（约0.5h）后用镊子取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，仔细辨认薄膜无光泽面，用微量进样器在无光泽面上点样。点样点距薄膜一端1.5cm，样点之间距离1.5cm。点样量为2～3μL，按少量多次原则分2~3次点完。

2．电泳：向两个电泳槽内注入pH4.8的柠檬酸缓冲液，缓冲液的高度约为电泳槽深度的3/4。（注意：两槽中电泳液面一致）。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后，将已点样薄膜的无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。

点样端置于负极方向，盖上电泳槽盖，接通电源，在电压降为10V/cm的条件下进行电泳，一小时后关闭电源，取出醋酸纤维素薄膜，用电吹风吹干。

3．鉴定：用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察，用铅笔划出各腺苷酸电泳斑点，并标明各斑点的腺苷酸代号。

绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱，以标准单核苷酸的迁移率作标准，鉴别试样中各组分。

五、附 注

1．电泳前，一定要检查电极正负极与薄膜方向，确定负极接在薄膜的点样一端，因为样品是带负电荷，接通电源后，样品要在薄膜上向正极泳动；确定薄膜的无光泽面朝下。

2．点样时，要控制点样点的大小在直径为2~3mm，样点不可太大，否则电泳后观察结果不理想。