Question

在PCR体系中怎样精确确定引物退火时间？

我在网上查的一般都是30~60sec的范围。请问怎么才能得出精确退火时间？

Answer 1

在PCR体系中精确确定引物退火时间的公式为：
1、当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT
2、对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10 + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Tm表示退火时间，Size = 引物长度。

退火，主要是指将材料曝露于高温一段很长时间后，然后再慢慢冷却的热处理制程。主要目的是：(1)释放应力，(2)增加材料延展性和韧性，(3)产生特殊显微结构。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

Answer 2

退火时间是非常次要的，我25s也做过，45s也做过，并没有什么区别。引物如果18-25bp的话，30s是足够的了。比起退火温度来，退火时间实在不算是决定因素~

Answer 3

哈哈，反复做实验，找到最佳时间！

Answer 4

引用zongdewangm16的回答：
在PCR体系中精确确定引物退火时间的公式为：
1、当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT
2、对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10 + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Tm表示退火时间，Size = 引物长度。

退火，主要是指将材料曝露于高温一段很长时间后，然后再慢慢冷却的热处理制程。主要目的是：(1)释放应力，(2)增加材料延展性和韧性，(3)产生特殊显微结构。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

Tm是退火温度，不是退火时间呀！