Question

包气带浅部土体微生物特征及其在氮素转化中的作用

Answer 1

包气带土体中生存着大量的种类繁多的微生物，这些微小的生物是自然界各种元素循环的枢纽，它们之间相互作用着，关系复杂。现已被人们研究过的只是很小一部分，能够在实验室培养研究的土壤微生物种类也仅占百分之几。根据项目研究的需要，利用野外试验场，结合室内培养实验，对氮的迁移转化相关的细菌进行了研究。

一、氮循环的微生物作用

氮循环是在微生物的推动下，进行形态转化的过程（图6-4）。氮在自然界中的存在形式主要有5种：铵盐、亚硝酸盐、硝酸盐、有机含氮物和大气中的氮气。氮循环的微生物作用主要是：

图6-4 自然界中的氮素循环

（引自《辞海》农业分册，1978）

（1）固氮作用：又称“生物固氮作用”。空气中分子状态的氮在某些土壤微生物作用下，经菌体细胞内固氮酶的活动，转化成化合态氮的过程。生物固氮作用的主要微生物类群有：共生固氮菌、自生固氮菌、蓝细菌等。细菌把氮气固定合成氨基酸，组成自身的蛋白质，死亡后通过异养微生物的矿化作用再释放出氨氮，被其他生物所吸收利用。

（2）矿化作用：一切生物死后细胞的有机氮在微生物作用下分解，也就是从蛋白质的降解中以游离氨的形式释放出来。氨能直接为微生物所利用，同化为有机体的组成物质。

（3）硝化作用：是有机物矿化作用中释放出来的氨，通过硝化细菌作用，经两个步骤而被氧化为亚硝酸盐和硝酸盐的过程。具体的转化过程如下（郑士民等，1983）：

第一步：

（148kcal）

第二步：

区域地下水演化过程及其与相邻层圈的相互作用

进行硝化作用的两类细菌为高度好氧的化能自养菌。亚硝化菌只能利用氨作为能源，硝化菌则只能利用亚硝酸盐作为能源。硝化细菌对环境条件具有较高的敏感性，如好氧环境，适宜的pH、最适温度为20～30℃等。虽然硝化细菌是化能自养菌，但必须在有机物存在的条件下才能活动。

（4）反硝化作用：在厌氧环境中反硝化细菌将硝酸盐逐步还原成气态氮（如 N₂、N₂O等）的过程称为反硝化作用。反硝化细菌有自养的也有异养的，但主要为异养菌。自养的反硝化菌主要为脱氮硫杆菌，异养反硝化菌的种类较多。反硝化作用发生的条件主要是在厌氧条件下，最适温度25℃，pH为中性。

自养反硝化作用反应式（翁稣颖等，1991）：

区域地下水演化过程及其与相邻层圈的相互作用

异养反硝化作用反应式（翁稣颖等，1991）：

区域地下水演化过程及其与相邻层圈的相互作用

式中A代表有机物的碳氢化合物。

（5）同化作用：微生物生长过程中吸取铵盐和硝酸盐形式的无机氮的过程称为同化作用。

以上氮转化过程，每一个环节均有微生物的参与，因此，对氮的循环研究离不开对相关细菌的研究。

二、与氮循环密切相关的细菌及其特点

（一）细菌总数

土壤往往具有各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，因此，土壤是微生物生存的良好环境。土壤中微生物数量很大，尤其是以细菌数量为最多，每克肥沃的土壤中所含细菌数可达几亿乃至几十亿，占土壤微生物总数的70%～90%（陈文新，1996；华中农业大学等，1992），据估算，每亩耕作层土壤中细菌湿重约有90～225kg，其干重约占土壤有机质（占土壤的2%）的1%（华中农业大学等，1992）。土壤中细菌的种类有几千种之多，其生理生化作用也极其复杂多样。测定土壤中微生物菌数的方法较多，各有利弊，都不能完全反映出其活的细菌总量，只能给出相对的概念，显然，相对的概念也是有意义的。它毕竟反映了土壤微生物生命活动的一定规律，为人们对各种不同生态环境进行相对比较提供了微生物学的依据。我们所选择的细菌总数测定方法是常规的肉汁蛋白平皿培养法。该方法测定的细菌总数绝大多数是腐生性中温好氧和兼性嫌气菌。此类细菌在土壤中有机物质和无机物质的转化过程中起着巨大作用，特别是在土壤中发生的使植物不能直接利用的复杂含氮化合物转化为可给态的含氮无机化合物的氨化作用过程中，这类微生物的作用尤为重要。细菌总数大，反映出包气带土体的生物量高，包气带土体的活性强，对氮的循环转化作用就大。

（二）自生固氮菌

该菌的作用主要是能从大气中直接利用氮，使气态氮转变为植物可以利用的形态，它对于土壤的氮补充和平衡起着重大的作用。该菌为好气性自生固氮菌，在适宜的条件下，它们每消耗1 g碳水化合物可固定10～20mg（陈文新，1996），了解它在土壤中的分布、数量、活动强度等变化，对评价土壤的氮素含量有重要的意义。其生长最适宜pH值为7.0，温度为25～30℃。

（三）硝化细菌

该细菌的主要作用就是将土壤中的

转化为硝酸盐，使土壤中的硝酸盐累积，土壤中硝化细菌的存在与活动，对于土壤肥力以及植物营养有着重要意义。由于硝酸盐的易迁移性，使地下水更易被氮污染。硝化菌是好氧性自养细菌，适宜于中或弱碱性环境生长，不能在强酸性条件下生长，生长最佳温度为20～30℃。在其生长代谢活动过程中能氧化亚硝酸盐为硝酸盐（反应式见“硝化作用”）。

氨氧化成硝酸盐的过程其硝化作用是由两类不同的硝化菌进行的，首先是亚硝化细菌（nitrobomonas）将氨氧化成亚硝酸盐，继之硝化细菌再氧化亚硝酸盐为硝酸盐。

（四）反硝化菌

反硝化菌是厌氧性异养菌，最适宜生长的pH值为7～7.5，在缺氧条件下利用硝酸盐中的氧，氧化有机物，还原硝酸盐为亚硝酸盐最终为N₂，反硝化过程反应式见“反硝化作用”。

反硝化菌是在硝酸盐与有机物同时存在而氧气不足的情况下发育生长进行代谢活动，反硝化菌是土壤及包气带硝酸盐的还原剂，对消解包气带土体及地下水中硝酸盐的污染具有重要的意义。

（五）脱氮硫杆菌

脱氮硫杆菌是厌氧性细菌，能生长在无机培养基中，能与硝酸盐在无游离氧的条件下生长，生长最适宜pH值为7～7.4，也能在碱性介质中生长。在其生命过程中能同化CO₂和重碳酸盐中的碳。在厌氧条件下氧化硫代硫酸盐形成硫酸盐，还能氧化硫及还原硝酸盐生成亚硝酸盐和氮气。其还原反应式（阎葆瑞等，1994）如下：

区域地下水演化过程及其与相邻层圈的相互作用

包气带土体及地下水中均分布有脱氮硫杆菌，在环境中存在硫化物和硝酸盐的情况下，使硝酸盐转化为氮气，且该菌为化能自养菌在无有机碳源的条件下，生长发育，是土壤包气带地下水中硝酸盐还原的重要因素之一。

三、包气带土体微生物生长的环境条件

包气带土体是微生物生长的主要栖息环境，其环境要素对微生物的生长繁衍有着重要的作用。试验场微生物的生长环境条件是：

（一）包气带土体的pH值

由于大部分细菌的最适宜酸碱度是近中性的：pH值为6.5～7.5，它们对pH的适应范围为4～10之间，细菌大多数要求中性和偏碱性。而强酸或强碱性条件有抑制许多普通细菌的趋势。试验场包气带土体pH值为6.22～8.65，大部分为8.1～8.3左右，为偏碱性环境。该环境有利于微生物的生长和繁衍。

（二）包气带土体的湿度

湿度以两种方式来调节微生物的活动。由于水是生物体的主要成分，供应适当，必定对于营养体发育有利。但是湿度太大，细菌的繁殖则受到抑制，并不是由于水分过多，而是过量的水分限制了气体的交换，降低了可利用态O₂的供应，造成了厌气环境，使好气性细菌生命活动受到抑制。试验场的土壤及包气带的含水量为2%～25%，是微生物生长的较好的湿度环境。

（三）包气带土体的温度

温度是调节生物生长繁衍的主要因素之一，温度的变化不仅影响细菌的数量也影响其质量的变化。每种微生物都有最适的生长温度，超过一定范围生长便停止。土壤中大多数微生物是中温性微生物，最适温度在25～30℃之间，并且在15～45℃内均能生长，5～50℃范围内可生存。在试验场包气带土体进行的温度观测结果见表6-3，从表中可以看出，土壤深40 cm以上15℃时的时间是从每年4月中旬至10月中旬；包气带深80～160 cm的15℃时的时间是5～10月，而深320 cm以下则为8～12月。地下水为恒温即15℃。从整个试验场的土壤的温度看，土壤中细菌的活动受季节的变化影响较大，细菌的主要活动期为春、夏、秋季。而包气带土体在恒温带以上部分受季节温度变化的影响；在恒温带以下则不受影响。

表6-3 1998年试验场包气带土体温度月平均值　单位：℃

（四）包气带土体E_h、有机质

E_h为氧化还原电位。氧化环境具有正电位，还原环境具有负电位。各种微生物要求氧化还原电位是不同的，一般好氧微生物要求E_h值为+300～+400mV，E_h值在+100mV以上好氧微生物生长。兼性厌氧微生物在E_h值为+100mV以上时进行好氧呼吸；E_h值为+100mV以下时进行无氧呼吸；专性厌氧细菌要求E_h值为-200～-250mV。氧化还原电位受氧分压的影响，氧分压高，氧化还原电位高；氧分压低，氧化还原电位就低。另外，在微域内由于好氧微生物的生长繁殖消耗了大量氧气，分解有机物产生氢气，使得氧化还原电位降低可产生局部的还原环境，使厌氧细菌得以生长繁殖。我们对试验场的土壤进行了E_h的测定，结果见表6-4。从表中可看出土壤E_h值在300～393mV之间，也就是好氧细菌繁殖的最佳氧化条件。

表6-4 1998年大田土壤E_h值测试结果　单位：mV

包气带土体的有机质是异养细菌的主要碳源，其有机物含量的多少也可反映细菌的多少，有机质含量高则细菌数量大，反之数量就少。研究区包气带土体有机质含量见图6-2。

总之，通过对试验场有关微生物生长环境的研究，包气带土体的pH、E_h及温度、有机质含量均具有对微生物的生长有利的条件，只是在恒温带以上的土体受季节变化的影响，如冬季微生物的活动因温度降低而减弱。

四、包气带土体微生物分布特征研究

为了研究包气带土体硝化、反硝化作用强度，我们在试验场及河北平原其他部位包气带土体进行了取样，分析了细菌总数、固氮菌数、硝化菌数、反硝化菌和脱氮硫杆菌。试验场土壤包气带细菌分析见表6-5至表6-9。从表中可看出在夏季不同时间内取样分析各类细菌，含量较多。细菌总数在0～30cm深度均在n×10⁶以上；30～100cm深度在n×10⁵以上。硝化细菌在0～10cm深度含量最高均在n×10⁷以上，10～30cm深度在n×10⁶以上，30～50cm深度在n×10⁵以上。说明硝化作用在夏季作用最强，特别是在土壤的上层。固氮菌在0～20cm深度为n×10⁶以上，20～50cm深度为n×10⁵以上，50～100cm深度为n×10⁴以上。固氮菌在土壤上层活动强、含量大。反硝化菌从表中可看出在雨季和灌水后有增高的趋势。如7月22日，7月28日均为灌水和降雨后取的样，而9月24日也是在雨季后取的样，由于土壤中含水量增大，气温高，土壤有机质易分解，则显示出反硝化菌的数量增高。在土壤的上层，深度30cm以上，其菌数在n×10⁵～n×10⁹以上，深度30cm以下，随有机质含量降低，其菌数有下降的趋势。脱氮硫杆菌是一自养兼性厌气菌，在土壤中的分布数量较前几种少，其活动强度也相对较弱，可能与土壤中硫酸盐的含量有一定的关系。

表6-5 1998年试验场大田土壤细菌总数取样分析结果　单位：个·g^-1

表6-6 1998年试验场大田土壤硝化菌分析结果　单位：个·g^-1

表6-7 1998年试验场大田土壤固氮菌分析结果　单位：个·g^-1

表6-8 1998年试验场大田土壤反硝化菌分析结果　单位：个·g^-1

表6-9 1998年试验场大田土壤脱氮硫杆菌分析结果　单位：个·g^-1

从以上各类细菌在土壤分布状况看，土壤上层各类细菌含量均高于下层，即在1m的深度内随深度的增加各类细菌的含量有下降的趋势。这和土壤的物理化学性质的变化有一定的相关性，如有机质、温度等变化。另外，从试验场整个包气带钻孔样品分析可见各类细菌在整个包气带均有分布，但随着岩性、物理化学条件的变化，而显现出不同的细菌含量，特别是在几个层次上出现细菌含量高的活化层。它的出现充分说明了细菌在包气带的分布，不是受深度变化所控制，而是受其环境条件所制约，如含水量、营养元素、土体岩性等。

试验场地下水细菌分析结果见表6-10，从表中可看出地下水中细菌总数含量较低，仅在n×10～n×10²之间，但有超过饮用水标准的数据出现。

表6-10 1998年试验场地下水观测孔细菌总数分析结果　单位：个·g^-1

在河北平原，我们从东部沿海至山前平原同时进行了包气带土体采样，对其微生物细菌含量进行了分析。分析结果见表6-11和表6-12，从表中可看出，细菌总数在海边（东部地区）比中部地区高，这和土壤有机质含量有关，东部海边土壤为淤泥质，含有较高的有机质，中部平原则含砂量较大，有机质含量较低，其它细菌的含量与分布特征同试验场内各类细菌分布、含量大体相同，只是随取样季节进入秋末，气温、地温降低，致使各类细菌含量均比实验场内的细菌含量略低一些。

表6-11 河北平原东部（海边）包气带土体细菌、有机质分析结果　单位：个·g^-1

（1998年10月28日取样，样号HB1）

表6-12 河北平原中部包气带土体细菌、有机质分析结果　单位：个·g^-1

（1998年10月30日取样，样号HB5）

五、包气带土体的硝化作用强度试验研究

包气带土体中的铵态氮在细菌的作用下，转化成硝态氮的过程，称为硝化过程。作用于硝化反应的细菌主要是亚硝化菌和硝化细菌，统称为硝化细菌。硝化过程大体上分为

→

→

两个阶段，但后一步反应速度比前一步反应快得多。硝化作用是氮素循环不可缺少的一环，也是氮流失的一个重要作用。为了查明包气带土体的硝化作用强度，我们选用试验场0.5～1.10m深度的土样进行了硝化作用强度的模拟试验。

（一）试验方法简介

试验所用化学试剂：NaNO₂，KNO₃，NH₄Cl，（NH₄）₂SO₄，Na₂SO₄等均为分析纯；主要仪器设备：QZD-1型电磁振荡器，电热生物恒温培养箱，无菌室，高速离心机等。化学分析方法：

用纳氏比色法，

用紫外分光光度法，

用α-奈胺比色法，试验用土样为正定实验场包气带0.5～1.10m 深的亚砂土，容重 ρ为1.36g/cm³，风干用2mm筛过筛备用。试验步骤：

（1）用四分法称取风干筛选土样15g，30份，分别置于Φ2.0cm试管中，棉塞塞口。

（2）取（NH₄）₂SO₄溶液，用蒸馏水配成含量为500×10^-6

溶液分别加入各装有土样的试管内3mL，使含水量达到20%左右。

（3）取上述10支试管进行高压蒸气灭菌，作为无菌对照，即为化学作用的转化试验。

（4）另取一支试管样作为试验初始含量，测试

、

、

的含量和细菌菌数。

（5）将上述所有试管样品均放入25℃恒温箱中培养，并保持恒温箱中的湿度，减少试管中水分蒸发。

（6）根据试验设计要求按取样时间取样，每次取出1 支试管，将含菌的试管在无菌室内取出1g土样进行硝化细菌菌数和细菌总数测试，对无菌对照样为隔次取样进行三氮分析。将试管内经培养的土样用50mL1mol Na₂SO₄溶液洗入150mL具塞三角瓶内，振荡30min后，离心取上清液测三氮。

（二）细菌硝化作用强度试验结果分析

试验测试结果见表6-13，此次试验为了真实地反映土壤中的硝化作用强度，未在所

试土样中加入其他任何试剂和营养，只是加入了

。从表中可以看出整个硝化作用的过程按

→

→

转化。而无菌对照

含量则变化不大，没有转化。从试验时间上看，因土样为风干样，在试验过程中开始有3～7d的硝化作用滞缓阶段，从第9～15d硝化作用开始增强，转化

的含量从初始浓度转化了18.97%～96.6%，变为强作用阶段。但从细菌培养上看细菌菌数的变化不是很大，其规律也不强。因细菌分析的培养条件不同，细菌分析用的培养基是细菌最佳生长条件，不同于此次硝化作用试验的条件，但在试验过程中细菌的作用效果是一样的。

表6-13 包气带土体硝化作用模拟试验测试结果　单位：10^-6

总之，通过试验研究，包气带土体在硝化细菌的作用下，15d可将

的96.6%转化为硝酸盐，并在42 d时将99.14%转化为硝酸盐，说明硝化细菌的作用是非常强的。

六、包气带土体反硝化作用强度试验研究

包气带土体的反硝化作用是：在反硝化细菌的参与下，土体中的硝酸盐和亚硝酸盐被还原，释放出NO、N₂O、N₂。该作用是氮循环的一部分，尤其对氮的环境污染问题研究具有一定的实际意义。为了查明包气带土体的反硝化作用强度，我们进行了反硝化作用强度的模拟试验。

（一）试验方法简介

试验用化学试剂、土样、测试方法、试验仪器同前述。试验步骤：

（1）用四分法取风干筛选的土样15g，分别置于试管中共30份。

（2）在试管中加入500×10^-6的KNO₃溶液3.0mL，而后用地下水加近满试管，用橡胶塞塞口，保持厌氧条件。

（3）其中10支试管为无菌对照，按无菌要求灭菌。

（4）将上述试管均置于25℃恒温箱培养。

（5）另取一支试管样用于测试

，

，

初始浓度。

（6）按设计要求的取样时间取样，分析

、

和

，细菌分析为反硝化菌菌数和细菌总数。

（二）细菌的反硝化作用强度试验结果分析

表6-14 包气带土体反硝化作用模拟试验测试结果　单位：10^-6

试验分析结果见表6-14。反硝化作用试验，为了真实地反映土壤反硝化作用强度，在所试验的土样中均未加任何其他营养成分。微生物的反硝化作用是异养还原作用，需要有碳源作为细菌的能量，其最低的C：N比为7：1，在没有增加其他碳源营养物质时，其

转化不彻底，到一定阶段就减弱了。从表6-14中可反映出此次试验土样的细菌反硝化作用强度。硝酸盐的消失量，第5 d为23.43%，第9 d为33.48%，第30 d为52%左右，以后则变化不大，也就是在土壤反硝化细菌作用下，土样所含碳源不增加的情况下，加入

含量为420.25×10^-6的浓度时，50%以上的

可以转化消失。而无菌对照则无反应，

、

和

含量变化不大。细菌总数、反硝化菌菌数的变化不十分明显，规律不强，这是培养条件不同所致。

总之，从反硝化作用强度试验看，土样在没有加入碳营养源的情况下，反硝化作用不彻底，这和硝化作用的细菌不同，硝化细菌为自养菌，不需碳营养源，而反硝化菌绝大部分为化能异养菌，必须有足够量的碳营养源，也就是有机物质作用为能量，才能维持其生长代谢使硝酸盐得以还原。因土样中缺少足够的碳源，所以试验结果显示，只有加入

的52%还原消失。此试验说明在包气带没有足够的碳源和厌氧环境条件下，则可使

大量流失进入地下水中，如能增加碳源和改变环境条件，则可阻控

的大量流失，防止地下水

污染。