Question

PCR 引物设计（1）

Answer 1

洁思隆新材料（苏州）有限公司是一家专注于PCR材料再生和科研的公司，为创造更加安全、舒适、纯净，便捷的人类生活提供全新的材料解决方案的新材料企业。推动人类生活环境的持续改善，创造美好生活。

洁思隆新材料(苏州)有限公司座落在有着“上有天堂，下有苏杭”之称的苏州，它也是一座园林城市。一座有底蕴的美丽城市，一家有责任的新兴公司。我们会在这花园的城市里，萃取自己的产品，不忘初心，为青山绿水，贡献自己的一点力量!

洁思隆新材料（苏州）有限公司，已深耕塑料行业多年。近年来随着经济的发展，环境的污染成为社会的主要议题，洁思隆新材料（苏州）有限公司认为一个有社会责任感的公司要为社会碳中和贡献自己一点力量。为此公司决定致力于塑料的循环利用，再生料的溯源，化学品的使用，环境的保护，社会责任的提升，洁塑隆一直在行动。

Answer 2

PCR是分子生化学生必备技能，简单朴实但是必不可少，是许多分子实验进行下去冲锋员。下面我们就一起来看看引物设计：

基本三原则是：引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。

1.引物的长度一般为20-25bp： 根据后续选择连接方式进行调整，双酶切后T4连接可以完全遵循20-25bp；同源重组需要设置同源臂和遵循酶说明书（一般同源臂含有15bp以上）

2.GC含量为40%-60%： 过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。最好能够实现四种碱基均匀分布。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴（引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大）

3.正向引物和反向引物的TM值要尽量接近，引物自身及引物之间不应存在互补序列： Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3'端不能选择A，最好选择T： 引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

5、碱基要随机分布： 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补： 引物自身存在互补序列，致使引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp.

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补： 两引物之间不应具有互补性，尤其需要避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8、引物3′端不可修饰： 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

9、引物5′端可以修饰： 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10、密码子简并性： 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

软件推荐使用：snapgene；primer premier 6；NCBI 

最近带师弟师妹做PCR有感，网上经验结合实际经验总结，有需要可以参考哦。

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                                                                                                                                                                                  Monster