Question

双脱氧链终止法的双脱氧测序的试剂及具体操作步骤

Answer 1

（以双链DNA测序为例）。 （1） 材料 Tris/葡萄糖缓冲液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmo1/L EDTA，50mmo1/L 葡萄糖），1% SDS，0.2mo1/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70%和无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。
（2） 配制方法
① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团，在室温下放置5分钟。
② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，然后离心5分钟。
③ 将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。
④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。
⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。
⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。
⑦ 取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠（pH 4.5）和8ml水。
⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。 以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。
（1） 材料 变性的双链DNA模板（溶解在TE缓冲液中），0.5pmol/mL寡核苷酸引物（溶解在TE中，-20℃贮存），5×测序缓冲液（200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃贮存），0.1mol/l DTT（当月新配-20℃贮存），15pmol/L的3种dNTP混合物（缺dATP），1 000至1 500Ci/mmol32p dATP（在－20℃下达4至6周），修饰的T7 DNA聚合酶，标准酶稀释溶液（20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L- 巯基乙醇，4℃贮存），终止混合物（表2-30），甲酰胺上样缓冲液（0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯青，10ml甲酰胺）。
表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物
反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度
H2O 15 15 15 15 －
5×测序缓冲液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
（2） 配制方法
① 取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板（分别为1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。
② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。
③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。
④ 短促离心后，在37℃下保温5分钟。
⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。 （1） 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。
（2） 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。
（3） 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。
（4） 电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。
（5） 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。
读取合成链的核苷酸序列时，应从下往上读取。因为电泳时是从上向下的，即上为负极，下为正极，DNA带负电，从负极向正极移动。其中，小片段DNA移动速度最快，距离正极的点样处最远。所以，应该从最小片段读起，即，从下向上读取。
而模板链则应该从上向下读取，并且转换为测序的核苷酸的互补的核苷酸。