Question

请问荧光定量PCR进行相对定量时，若是目的基因和内参基因扩增效率不一致，为什么会导致结果的不准确？

那么怎么平衡扩增效率呢？

Answer 1

你先得弄清相对定量什么意思，举个例子，样品a和样品b中检测基因Y的表达水平，以b-actin为内参，相对定量就是用样品a中的基因Y的量除以b-actin得到值y1，用样品b中的基因Y的量除以b-actin得到值y2，然后y1/y2就是基因y在样品a和b中的相对表达水平。若基因Y和b-actin扩增效率不一致，那么y1/y2就不能反映实际情况了。
扩增效率是由退火温度和引物效率决定的，需要试多个退火温度和多对引物，希望有帮助

Answer 2

相对定量有两种方法。要求扩增效率相同的是ΔΔCt法，因为只有扩增效率相同目的基因与内参基因的Ct值之差才是恒定的值，这是使用这种方法处理数据的前提，所以正式实验之前要进行条件优化，这种方法的优势是不用作标准曲线。如果扩增效率不同就要用另一种双标准曲线法，这种方法需要标准品，稀释不同的浓度梯度，作标准曲线，根据标准曲线得到你的拷贝数在进行数据处理，得到相对值。
希望能对你有帮助……